論文摘要：含中藥龍血竭的血清處理方法研究在供試品溶液圖譜上選取5個特征峰較明顯的成分作為檢測指標(biāo)，保留時間分別為10.232、15.498、26.665、35.732、38.732 min，其中峰4和峰5經(jīng)驗證，確定為龍血素A(4′羥基2,4二甲氧基二氫查耳酮)和龍血素B(4′羥基2，4，6三甲氧基二氫查耳酮)[4]，峰1、2和3結(jié)構(gòu)未知。由上圖可知，空白血清樣品無干擾。
關(guān)鍵詞：龍血竭,含藥血清,蛋白沉淀
引言
研究含中藥龍血竭的血清處理方法。方法采用適宜蛋白沉淀劑并以有機(jī)溶劑提取處理含中藥龍血竭的血清樣品，測定含藥血清的HPLC圖譜，以龍血竭溶液中5個特征成分的峰面積為對照計算提取率，確定制備含藥血清的最佳方法。結(jié)果通過乙腈沉淀蛋白，采用乙酸乙酯進(jìn)行提取，可使含藥血清中龍血竭特征成分的提取率達(dá)到80%以上。結(jié)論本法可作為龍血竭含藥血清的制備方法。
龍血竭為傳統(tǒng)中藥,是龍舌蘭科植物劍葉龍血樹[Dracaena cochinchinensis(Lour)S.C.Chen]含樹脂木材的乙醇提取物[1]。龍血竭總黃酮(sanguis draconis flavones,SDF)是從龍血竭中提取得到的主要成分[2]，包括黃酮、二氫黃酮、黃烷、查耳酮、二氫查耳酮等20多種化合物[3]。動物實驗表明，龍血竭總黃酮能對抗整體動物心肌缺血損傷[2]。本實驗將龍血竭HPLC圖譜中特征峰較明顯的5個成分的峰面積作為檢測指標(biāo)(其中2個主要成分為龍血素A和龍血素B)，以龍血竭原溶液為對照計算體外加樣后提取百分率，進(jìn)行血清處理方法的研究。
1、儀器與試劑
Waters高效液相色譜儀：515 HPLC泵,2487雙波長吸收監(jiān)測器,N2000雙通道色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所);TDL802B臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);超聲儀(上海超聲波儀器廠);TU1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);ZH2 BLENDER渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)。
廣西產(chǎn)龍血竭(廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠提供);龍血素A、龍血素B對照品(中國藥品生物制品檢定所提供);乙腈(色譜純);甲醇，乙酸乙酯，丙酮，正丁醇，乙醚，三氯甲烷，正戊醇，95%乙醇，無水乙醇，三氯醋酸，均為分析純;新西蘭大耳白兔(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供)。
2、HPLC法的建立
2.1色譜條件
色譜柱：Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);保護(hù)柱：Easyguard C18 Replacement Cartridges Cat#6101;流動相：乙腈1%冰醋酸(體積比38∶62);檢測波長：280 nm;流速：1.2 mL/min。
2.2溶液的制備
取龍血素A、龍血素B對照品適量，用甲醇分別配制成每1 mL含10 μg的溶液，作為對照品溶液。
取廣西龍血竭，用甲醇配制成每1 mL含2 mg的溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.3線性范圍
將龍血素A對照品溶液分別配制成濃度為0.925、4.625、9.250、13.875、18.500、23.125 μg/mL的溶液，進(jìn)樣10 μL,記錄色譜圖，進(jìn)樣量(m)與峰面積(A)的回歸方程為：A=45 064 451m-10 379 768，r=0.999 2，線性范圍為9.25～231.25 ng。
同上，將龍血素B對照品溶液分別配制成濃度為0.947、4.735、9.470、14.205、18.940、23.675 μg/mL的溶液，進(jìn)樣10 μL,記錄色譜圖，進(jìn)樣量(m)與峰面積(A)的回歸方程為：A=33 227 615m-10 135 858，r=0.999 0，線性范圍為9.47～236.75 ng。
2.4穩(wěn)定性試驗
取“2.2”項下的供試品溶液分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)行檢測，分別記錄5個特征性成分的峰面積，相應(yīng)峰面積的RSD值分別為1.83%、3.09%、2.89%、2.47%、2.05%，即供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。
2.5供試品溶液HPLC圖譜
取“2.2”項下的供試品溶液，龍血素A、龍血素B對照品溶液及空白血清樣品，各進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC圖譜，見圖1。
圖1供試品溶液(A)、龍血素A對照品(B)、龍血素B對照品(C)及空白血(D)HPLC圖譜 略
含中藥龍血竭的血清處理方法研究在供試品溶液圖譜上選取5個特征峰較明顯的成分作為檢測指標(biāo)，保留時間分別為10.232、15.498、26.665、35.732、38.732 min，其中峰4和峰5經(jīng)驗證，確定為龍血素A(4′羥基2,4二甲氧基二氫查耳酮)和龍血素B(4′羥基2，4，6三甲氧基二氫查耳酮)[4]，峰1、2和3結(jié)構(gòu)未知。由上圖可知，空白血清樣品無干擾。
3、結(jié)果與討論
3.1提取率的計算
特征性成分的提取率=血清樣品中特征性成分的峰面積/供試品溶液相應(yīng)成分的峰面積×100%
3.2血漿樣品的處理方法
3.2.1蛋白沉淀劑的選擇
實驗中發(fā)現(xiàn)，供試品溶液與10%三氯醋酸會發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，故使用常用的蛋白沉淀劑甲醇、乙腈、無水乙醇、丙酮進(jìn)行處理。
由兔耳緣靜脈取血約2 mL，置離心管中，加入供試品溶液1 mL，渦旋混合，分別加入各種蛋白沉淀劑甲醇、乙腈、無水乙醇和丙酮適量，離心，取上清液，水浴揮干后精密加入1 mL甲醇，超聲溶解，0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標(biāo)性成分的峰面積為對照，計算得各成分的提取率見表1。
表1不同蛋白沉淀劑制備含藥血清的特征峰的提取率 略
從表1可見，以甲醇作蛋白沉淀劑對5個特征峰的提取率均較低，丙酮次之，乙腈和無水乙醇相對高一些，但對峰3的提取率均低于50%，證明4種處理過程均無法避免血漿蛋白對藥物的吸附，無法達(dá)到理想的提取效果。
按上述實驗步驟，在分別加入蛋白沉淀劑后，加入與血樣同等量的乙酸乙酯，提取3次，渦旋混合，離心，取乙酸乙酯層，合并提取液，水浴揮干，精密加入1 mL甲醇，超聲溶解，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標(biāo)性成分的峰面積為對照，計算得各成分的提取率見表2。
從表2可見，含藥血清在使用不同蛋白沉淀劑后，通過同種有機(jī)溶媒——乙酸乙酯進(jìn)行提取，可不同程度提高5個特征性成分的提取率，以無水乙醇組提高效果最不明顯，甲醇、乙腈、丙酮組均有顯著提高，且乙腈組對5個特征峰的提取率均達(dá)到80%以上。
表2不同蛋白沉淀劑與溶媒結(jié)合提取制備含藥血清的特征峰的提取率 略
3.2.2提取次數(shù)的選擇
使用乙腈作為蛋白沉淀劑，加入與血樣同等量的乙酸乙酯，分別按2、3、4次進(jìn)行提取，水浴揮干后精密加入1 mL甲醇，超聲溶解，0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標(biāo)性成分的峰面積為對照，計算得各成分的提取率見表3。
表3不同提取次數(shù)制備含藥血清的特征峰的提取率 略
由表3結(jié)果可見，使用與血樣同等量的乙酸乙酯提取3次(見圖2)的效果明顯優(yōu)于提取2次，當(dāng)提取次數(shù)為4次時，對各特征性成分的提取率影響則較小，再增加提取次數(shù)意義不大。
3.2.3提取溶劑的選擇
使用乙腈作為蛋白沉淀劑，采用其他種類提取溶劑如正丁醇、乙醚、氯仿對血樣進(jìn)行處理。以供試品溶液5個指標(biāo)性成分的峰面積為對照，計算各成分提取率見表4。
圖2含中藥龍血竭血清HPLC圖譜 略
表4不同提取溶劑制備含藥血清的特征峰的提取率 略
正丁醇對于峰2、4、5的提取率達(dá)到80%以上，但對峰1和3的提取率均低于75%;而乙醚和氯仿對峰3的提取率均低于50%，不及使用乙酸乙酯為提取溶劑的效果。
4、結(jié) 論
將含中藥龍血竭的血清先通過乙腈沉淀血漿蛋白，再使用與血樣同等量的乙酸乙酯提取3次，可使龍血竭中5個特征性成分的提取率達(dá)到80%以上。本研究結(jié)果可為中藥龍血竭的體內(nèi)藥動學(xué)研究提供依據(jù)。
【參考文獻(xiàn)】
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[2] 方偉蓉，李運(yùn)曼，鄧嘉元.龍血竭總黃酮對動物心肌缺血的保護(hù)作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10(9)：1020-1024.
[3] 張慶云，朱輝.龍血竭研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，13(1)：69-71.
[4] 周志宏，王錦堯.龍血竭的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2001，32：484-486.
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