兩個(gè)新臺(tái)糖甘蔗品種的GISH分析

　　【摘 要】用 DIG 標(biāo)記的原始親本印度割手密(父本)DNA 和用 Biotin 標(biāo)記的原始親本黑車?yán)锉?母本)DNA 為探針?lè)謩e對(duì) 2(新臺(tái)糖 25 和新臺(tái)糖 16)個(gè)云南甘蔗主栽品種進(jìn)行雙色基因組原位雜交(GISH)。由雜交結(jié)果可以看出，在 2 個(gè)供試甘蔗栽培品種的基因組中，含有栽培原種—— 熱帶種(黑車?yán)锉?血緣的染色體有 82-96 條，含有野生種——割手密(印度割手密 1、印度割手密 2)血緣的染色體有 10-25 條，而發(fā)生交換、重組的染色體有 2-4 條，都表現(xiàn)出明顯的差異。GISH 技術(shù)為揭示甘蔗栽培品種基因組的血緣組成差異提供了科學(xué)依據(jù)。

　　本文源自羅宗蘋， 農(nóng)家參謀 發(fā)表時(shí)間：2019-06-14《農(nóng)家參謀》(月刊)創(chuàng)刊于1983年，是由河南省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)主辦的服務(wù)農(nóng)家發(fā)展的刊物。本刊始終堅(jiān)持“面向農(nóng)村、立足農(nóng)業(yè)、服務(wù)農(nóng)民”的辦刊宗旨，不遺余力地傳播先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)與最新的致富信息，培育出了一批種植、養(yǎng)殖高手和市場(chǎng)經(jīng)營(yíng)能手，無(wú)數(shù)讀者在《農(nóng)家參謀》的指導(dǎo)下，擺脫了貧困，走上了富裕之路，成為至富帶頭人。

　　【關(guān)鍵詞】甘蔗;染色體;基因組原位雜交

　　甘蔗(S.sinense Roxb )不僅是世界和我國(guó)最主要的糖料作物，而且在能源和動(dòng)物飼料開發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。甘蔗優(yōu)良品種的育成，有賴于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用。甘蔗是高度多倍性的植物，現(xiàn)代甘蔗栽培品種是一個(gè)遺傳背景復(fù)雜的多倍體 , 其基因組的主體成份為熱帶種血緣 , 同時(shí)又導(dǎo)入不少近緣種血緣 , 如割手密種、印度種、大莖野生種、中國(guó)種和斑茅等面對(duì)甘蔗復(fù)雜的遺傳特性，人們?yōu)榱烁畹难芯扛收幔诟收嵫芯考夹g(shù)上應(yīng)用了原位雜交。原位雜交 (in situ hybridization) 技術(shù)是 1969 年由 Gual 和 Par 首次提出的。它是一種把核酸分子雜交技術(shù)與組織學(xué)定位相結(jié)合的 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，即利用標(biāo)記的 DNA 探針 (probe) 與染色體上的 DNA 雜交，以檢測(cè)細(xì)胞中特定基因在染色體上的位置、活性和表達(dá)。因這種雜交是待測(cè) DNA 分子位置不變而進(jìn)行的雜交，所以稱之為“原位雜交”，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

　　基因組原位雜交 (GISH) 是利用標(biāo)記物標(biāo)記基因組總 DNA，以其作探針與染色體制片進(jìn)行原位雜交檢測(cè)目標(biāo) DNA 的一種技術(shù)。甘蔗的根尖染色體制片較難獲得清晰干凈的染色體，本研究借鑒 GISH 技術(shù)在植物上的應(yīng)用，從制取甘蔗良好的染色體制片入手，改進(jìn)探針標(biāo)記條件，確定恰當(dāng)?shù)奶结樋?DNA 與封阻總 DNA 的濃度比例，建立甘蔗 GISH 分析技術(shù)體系。為甘蔗創(chuàng)新種質(zhì)材料的保存及在甘蔗育種中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為新臺(tái)糖抗逆、廣適、高產(chǎn)、高糖的新品種的培育或?qū)σ恍┎涣继匦缘倪M(jìn)行改良。甘蔗育種家對(duì)常用的親本材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析 , 發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有親本主要來(lái)自常用的原始祖先熱帶種、印度種、割手密和大莖野生種 , 全世界甘蔗栽培種十之八九均含有這幾個(gè)親本血緣。目前，云南高原蔗區(qū)，在主栽品種中，新臺(tái)糖品種(ROC10、ROC16、ROC20、ROC22、ROC25)的種植面積約占總面積的 45%，查閱以上新臺(tái)糖甘蔗主栽品種的血緣關(guān)系可以看出：5 個(gè)臺(tái)灣品種(ROC10、ROC16、ROC20、ROC22、ROC25)除了含有傳統(tǒng)的熱帶種、印度種、中國(guó)種、割手密野生種等原始親本的血緣外，又增加了“大莖野生種”的血緣，是大莖野生種的第 4、5 代;這些原始親本(祖親種)在栽培品種血緣中具有關(guān)鍵作用，云南主栽的這些甘蔗品種都有比較完整的系譜記錄，為雜交親本的選配提供了重要依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1  試驗(yàn)材料及所使用的儀器設(shè)備

　　1.1.1  試驗(yàn)材料

　　云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗所甘蔗資源圃所種植的新臺(tái)糖 25 和新臺(tái)糖 16 的幼嫩根尖。

　　1.1.2  試驗(yàn)儀器及設(shè)備

　　離心機(jī)、低溫冰箱、PCR 儀、干燥箱、水浴鍋、移液槍、ZEISS 熒光顯微鏡等。

　　1.2  試驗(yàn)方法

　　1)試驗(yàn)材料的種植;2)玻片的準(zhǔn)備;3)探針的獲得與標(biāo)記;4)雜交預(yù)處理;5)雜交;6)雜交后的洗脫;7)雜交信號(hào)的檢測(cè)。

　　2 結(jié)果與分析

　　本實(shí)驗(yàn)以 Biotin 標(biāo)記的熱帶種黑車?yán)锉?DNA 作為母本探針、采用 DIG 標(biāo)記野生種印度割手密 DNA 作為父本探針，與云南主栽的新臺(tái)糖 25和新臺(tái)糖 16 甘蔗品種進(jìn)行單、雙色雜交，染色體底色則用 DAPI 襯染，雜交圖可以看到染色體上都有雜交信號(hào)。

　　基因組原位雜交中，經(jīng) DIG 標(biāo)記系統(tǒng)標(biāo)記后的父本 DNA 探針雜交信號(hào)為紅色，經(jīng) Biotin 標(biāo)記系統(tǒng)標(biāo)記后的母本 DNA 探針雜交信號(hào)為綠色。雙色原位雜交中(圖 1，圖 2)，母本探針的雜交信號(hào)仍為綠色，而 DIG 標(biāo)記的父本探針的雜交信號(hào)除紅色外還會(huì)出現(xiàn)橙紅色，雙親探針的交叉雜交信號(hào)則為黃色，由結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母本探針既能與母本染色體出現(xiàn)雜交(呈綠色)又能與父本染色體在特定區(qū)域雜交(呈黃色)，同時(shí)父本探針也不僅與父本的整條染色體雜交(呈紅色或橙紅色)，還與母本染色體的特定區(qū)域發(fā)生部分雜交(呈黃色)。

　　圖1中 A：淺紫色為 DAPI 襯染的檢測(cè)信號(hào)。B：紅色代表 DIG 標(biāo)記的父本 DNA 探針的雜交信號(hào)，C：以印度割手密及熱帶種黑車?yán)锉?DNA 標(biāo)記的探針與新臺(tái)糖 25(ROC25)得到染色體進(jìn)行雙色原位雜交的結(jié)果(比例 =10 µm)。A—C 中的白色長(zhǎng)箭頭示完整的父本染色體，白色短箭頭示父本染色體斷片，藍(lán)色箭頭示父母本間的重組染色體。

　　圖2中 D：淺紫色為 DAPI 襯染的檢測(cè)信號(hào)。E：紅色代表 DIG 標(biāo)記的父本 DNA 探針的雜交信號(hào)，F(xiàn)：以印度割手密及熱帶種黑車?yán)锉?DNA 標(biāo)記的探針與新臺(tái)糖 16(ROC16)得到染色體進(jìn)行雙色原位雜交的結(jié)果(比例 =10 µm)。D—F 中的白色長(zhǎng)箭頭示完整的父本染色體，白色短箭頭示父本染色體斷片，藍(lán)色箭頭示父母本間的重組染色體。

　　3 討論與結(jié)論

　　3.1  討論

　　1)基因組原位雜交(GISH )是對(duì)遠(yuǎn)緣雜交后代中的染色體進(jìn)行鑒定的有效工具，用不同標(biāo)記系統(tǒng)標(biāo)記的雙親 DNA 探針可將來(lái)自不同親本的染色體有效區(qū)分開來(lái)，即便對(duì)親緣關(guān)系較近的親本間雜交獲得的后代材料的染色體也能獲得理想的鑒定結(jié)果;

　　2)傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為不同染色體間的交換現(xiàn)象，只出現(xiàn)在減數(shù)分裂時(shí)聯(lián)會(huì)配對(duì)的同源染色體之間，而不會(huì)在有絲分裂過(guò)程中出現(xiàn)。但也有研究發(fā)現(xiàn)染色體的重組現(xiàn)象發(fā)生于物種間雜交 F1 代，王先宏等的研究也在 YAU 01/49 后代材料中發(fā)現(xiàn)有 2 條染色體可能源于父、母本染色體間的互換，但是還有待進(jìn)一步加以研究證實(shí)。因此有人推測(cè)不同染色體間的交換現(xiàn)象可能來(lái)自于受精后體細(xì)胞的有絲分裂，而與減數(shù)分裂過(guò)程無(wú)關(guān);

　　3)本實(shí)驗(yàn)以 Biotin 標(biāo)記的熱帶種(黑車?yán)锉?DNA 作為母本探針、采用 DIG 標(biāo)記割手密(印度 1 號(hào)、印度 2 號(hào))DNA 作為父本探針，與云南主要栽培的新臺(tái)糖 25 和新臺(tái)糖 16 甘蔗品種進(jìn)行單、雙色雜交，染色體底色則用 DAPI 襯染。雜交結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，幾乎每個(gè)品種都有 2-4 條染色體各自的末端部分，都很明顯的出現(xiàn)了另一親本的探針雜交信號(hào)，可能是種重復(fù)序列表現(xiàn)出來(lái)的信號(hào)，也可能是母本的 1 條染色體與父本的一條染色體分別在末端出現(xiàn)交換，而形成了染色體的重組。

　　3.2  結(jié)論

　　本實(shí)驗(yàn)中材料的染色體組成

　　注：Ss：父本(印度割手密)，So：母本 ( 熱帶種 )，Ss & So：父母本間的重組染色體。

　　通過(guò) GISH 技術(shù)在 2 個(gè)甘蔗栽品種新臺(tái)糖 25 和新臺(tái)糖 16 的基因組中的實(shí)驗(yàn)得出：含有栽培原種——熱帶種(黑車?yán)锉?血緣的染色體有 82-96 條，含有野生種——割手密(印度割手密 1、印度割手密 2)血緣的染色體有 10-25 條，而發(fā)生交換、重組的染色體有 2-4 條，都表現(xiàn)出明顯的差異，為揭示甘蔗栽培品種新臺(tái)糖 25 和新臺(tái)糖 16 基因組的血緣組成差異提供了科學(xué)依據(jù)。