作者：陳葉福 李軍俠 沈世超 呂鴻雁 肖冬光 單位：工業發酵微生物教育部重點實驗室 天津科技大學生物工程學院

培養基（1）YEPD培養基（斜面培養及平板純化用）：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，瓊脂20g/L，pH6.0，0.1MPa滅菌15min。（2）種子培養基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH6.0，0.1MPa滅菌15min。（3）GSH發酵培養基：葡萄糖30g/L，酵母粉7g/L，KH2PO41g/L，K2HPO4•3H2O2.5g/L，MgSO40.1g/L，pH值自然，0.1MPa滅菌15min。

培養方法種子培養從活化后的斜面上挑取一環接入種子培養基中，30℃靜置培養24h。GSH發酵種子液以10%的接種量，接入發酵培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶）中，28℃、160r/min搖瓶培養22h。

鎘鹽抗性篩選向融化后的YEPD固體培養基中加入不同體積0.5mol/L的鎘鹽母液，制成含有不同鎘鹽濃度的梯度平板。將酵母菌株劃線于梯度平板上，30℃培養3d～4d，觀察菌落生長情況。紫外誘變育種參照參考文獻[6]。谷胱甘肽提取熱水抽提法[7]。谷胱甘肽生成量測定ALLOXAN試劑衍生法[8]。

正突變株與正突變將GSH產量或GSH胞內含量較原株有顯著提高（提高幅度大于5%）的突變株定義為正突變株，相應的突變為正突變。2結果與分析2.1發酵過程中添加鎘鹽對釀酒酵母產GSH的影響據文獻報道[9]，釀酒酵母發酵產谷胱甘肽（GSH）過程中添加微量鎘鹽可以提高GSH生成量。由于鎘離子對菌體生長具有很強的毒害作用，因此，必須確定鎘鹽添加的時間和濃度，以消除鎘鹽對菌體生長的影響，這樣才能準確考察鎘鹽對菌體GSH生成量的影響。

發酵過程中添加鎘鹽時間的確定繪得釀酒酵母B-3發酵生長曲線見圖1，發酵第3h進入對數生長期；第8h～11h，菌體生長速度減慢，并緩慢進入生長衰退期。為了減少鎘鹽對酵母菌體生物量的影響，定于發酵第11h加入適量濃度的鎘鹽。

發酵過程鎘鹽添加濃度的確定釀酒酵母B-3GSH發酵第11h時，向發酵液中添加不同體積0.50mol/L的鎘鹽母液，使各發酵液中鎘鹽的最終濃度分別為0、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、5.0mmol/L、7.0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L，發酵22h后測定菌體生物量，結果見表1。由表1可知，當發酵液中鎘鹽濃度達到5.0mmol/L時，對菌體生長的影響比較明顯。因此，下述實驗選擇發酵過程中添加低于5.0mmol/L濃度的鎘鹽，以消除發酵過程中鎘鹽對菌體生長的影響。

發酵第11h和第21.5h添加鎘鹽對釀酒酵母B-3GSH生成量影響釀酒酵母B-3GSH發酵第11h和第21.5h（即發酵結束前0.5h）時，向發酵液中添加不同體積的0.50mol/L鎘鹽母液，使各發酵培養基中鎘離子濃度為0、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、1.7mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L，發酵22h后測定GSH生成量。由圖2、圖3可知，釀酒酵母B-3GSH發酵第11h和第21.5h（即發酵結束前0.5h）分別添加2.0mmol/L和1.0mmol/L鎘鹽，GSH產量比沒有添加鎘鹽時分別提高了27.4%和47.3%，而胞內GSH含量則分別提高70.1%和45.0%。結果表明，釀酒酵母GSH發酵中期和末期，添加適量的鎘鹽可以有效提高GSH產量。有研究表明，重金屬（如鎘、砷）可以特異性阻遏酵母硫代謝途徑中轉錄促進因子Met4遍在化失活作用，從而使Met4保持轉錄促進活性，增加GSH生成量以達到解除重金屬毒害的作用[10]。上述實驗也驗證了添加一定濃度的鎘鹽可以提高釀酒酵母GSH生成量。但是，由于鎘鹽具有很強的毒性，不能在GSH發酵過程中以直接添加誘導GSH生成的形式達到高產的目的，這樣既影響GSH的下游分離與工業廢水處理，又不符合食品安全規定。因此，能否采用誘變育種方法獲得高鎘鹽抗性的釀酒酵母突變株，通過增加酵母自身的鎘鹽抗性，將這種鎘鹽誘導型提高GSH的生成方式轉變為組成型，在不添加鎘鹽條件下提高GSH生成量，將是下面研究的主要方向。

釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間關系的驗證本實驗室現存有一株利用復合誘變方法，經ZnCl2抗性平板篩選得到的一株高產GSH釀酒酵母突變株B-3和多株經離子注入所得的BL系列高產GSH突變株，其GSH生成量均明顯高于釀酒酵母BY-14。本部分研究，以上述菌種為實驗菌株，通過菌株GSH生成量和鎘鹽抗性比較，驗證釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間的關系，為高鎘鹽抗性釀酒酵母突變株篩選體系的建立奠定了理論基礎。2.2.1釀酒酵母GSH生成量比較按照方法1.2.2，對BY-14、B-3、BL17、BL19、BL31分別進行GSH發酵實驗，測定其GSH生成量，結果見表2。由表2可知，釀酒酵母B-3、BL17、BL19和BL31GSH產量和胞內GSH含量均明顯高于釀酒酵母BY-14。2.2.2釀酒酵母鎘鹽抗性比較按照方法1.3.1，將釀酒酵母BY-14劃線接種于濃度分別為0、0.30mmol/L、0.35mmol/L、0.40mmol/L、0.45mmol/L、0.50mmol/L、0.55mmol/L、0.60mmol/L的鎘鹽抗性平板上，30℃培養3d~4d，觀察其菌落生長情況。由表3可知，釀酒酵母BY-14在0.50mmol/L鎘鹽抗性平板上有較弱的生長，而在0.55mmol/L鎘鹽抗性平板上不能生長。故選擇含0.55mmol/L鎘鹽的YEPD平板作為鎘鹽抗性驗證平板。將釀酒酵母BY-14、B-3、BL17、BL19、BL31分別劃線接種于含0.55mmol/L鎘離子的YEPD平板上進行鎘鹽抗性驗證，30℃培養3d~4d，觀察菌體生長情況，結果見圖4。由圖4可知，除菌株BY-14外，其余4株菌在含有0.55mmol/L鎘鹽的抗性平板上均生長良好。實驗表明，釀酒酵母B-3、BL17、BL19、BL31鎘鹽抗性高于BY-14。以上結果表明，釀酒酵母BY-14GSH生成量明顯低于B-3、BL17、BL19、BL31；同時，BY-14鎘鹽抗性也明顯低于其他實驗菌株。因此，可以初步確定釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間的關系，即釀酒酵母GSH生成量越高，其鎘鹽抗性越強。反之，鎘鹽抗性越強，其GSH生成量越高是否成立，仍須實驗予以證明。因此，后續實驗將利用紫外誘變方法，通過鎘鹽抗性篩選獲得高鎘鹽抗性釀酒酵母突變株，如果可以獲得GSH生成量提高的正突變株，就為建立一種高產GSH釀酒酵母突變株的篩選方法提供了實驗依據，同時，也會為釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間關系作出重要補充。

鎘鹽抗性篩選平板的確定按照方法1.3.1，將釀酒酵母B-3和M8劃線接種于含有不同濃度鎘鹽的抗性驗證平板上，30℃培養3d~4d，觀察其菌落生長情況，結果見表4。由表4可知，釀酒酵母B-3、M8在0.20mmol/L和0.30mmol/L鎘鹽抗性平板上有較弱生長，而在0.25mmol/L和0.35mmol/L鎘鹽抗性平板上不能生長。故選擇含0.25mmol/L、0.35mmol/L硫酸鎘的YEPD平板分別作為釀酒酵母B-3和M8紫外誘變初篩平板。