作者：曹喜濤 陳凱 李揚 竇潔 王慧 周長林 奚濤 單位：中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)并且具有重要生理功能的活性物質(zhì)。它參與體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、磷脂、體內(nèi)激素和神經(jīng)遞質(zhì)生物合成和代謝等40多種生物反應(yīng)［6-7］。可用于治療抑郁癥［8］、關(guān)節(jié)炎［9］、肝功能紊亂等疾病［10］、阿爾茲海默病［11］，具有起效快，副作用小，安全可靠等特點。隨著SAM的價值逐漸被人們所認(rèn)識，市場需求量也日趨增長［12］。目前美國市場常見的SAM成品藥主要為歐洲進口的硫酸對甲苯磺酸鹽雙鹽，還有部分產(chǎn)品為美國產(chǎn)穩(wěn)定性更好的聚丁基磺酸鹽。而國內(nèi)盡管進行了很多研究，但一直未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。釀酒酵母是常見的真核生物，并且其全基因組序列已經(jīng)測定完成，被美國食品與藥品安全管理局(FDA)認(rèn)證為安全的微生物(GRAS，Generallyrecognizedassafe)［13］。利用釀酒酵母生產(chǎn)SAM已有的研究主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選和誘變［14-17］、發(fā)酵條件的優(yōu)化［18-24］、SAM2的過表達和DNAShuffling［25-31］、CBS基因敲除［32］等，但是這些研究主要集中在單個基因的過表達或者敲除的研究，同時也未見商業(yè)化應(yīng)用的報道。本文采用gTME技術(shù)，通過對RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的TATA結(jié)合蛋白之一的SPT15和TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子之一TAF25編碼的基因進行易錯PCR，建立突變文庫，構(gòu)建重組釀酒酵母菌株，研究了gTME對釀酒酵母SAM代謝的影響，為獲得工業(yè)化生產(chǎn)菌株建立基礎(chǔ)。

1材料與試劑

1.1質(zhì)粒和菌種pMD18-TVector克隆載體購自Takara公司，質(zhì)粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6由天津大學(xué)王靜宇惠贈，質(zhì)粒pYES2.0由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院趙云坡博士惠贈，大腸桿菌E.coliDH5α、釀酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846由中國藥科大學(xué)微生物教研室保存。

1.2試劑限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、NheI、T4DNA連接酶、Taq酶、PCR相關(guān)試劑、質(zhì)粒提取試劑盒均購自Takara公司。限制性內(nèi)切酶AgeI、凝膠回收試劑盒購自Fermentas公司，氨芐青霉素鈉鹽、Geneticin(G418硫酸鹽)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。易錯PCR試劑盒為藍罡生物購自北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司。引物合成、DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。1.3培養(yǎng)基大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)(g/L):酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl10，轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)時添加50μg/mL氨芐青霉素。釀酒酵母用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)(g/L):酵母提取物10，蛋白胨10，葡萄糖20，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉和120μg/mLG418。篩選高產(chǎn)SAM菌株時采用O-medium(g/L)［33］:葡萄糖50，蛋白胨10，酵母提取物5，KH2PO44，K2HPO42，MgSO4•7H2O1.5，L-met3，pH6.0。

2方法

2.1釀酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846基因組的提取根據(jù)參考文獻［34］采用玻璃珠破碎的方法提取釀酒酵母基因組，作為擴增SPT15和TAF25基因的模板。

2.2spt15和taf25基因的克隆及其易錯PCR文庫的建立本研究中所用的引物見表1。轉(zhuǎn)錄因子spt15和taf25采用PCR的方法，以釀酒酵母總DNA為模板，擴增出的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠試劑盒回收后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α。將正確轉(zhuǎn)化的E.coliDH5α由南京金斯瑞生物科技有限公司進行DNA測序。測得的基因序列登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，進行序列比對。以獲得的SPT15和TAF25基因為模板，依據(jù)易錯PCR試劑盒的說明進行易錯PCR，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子spt15和taf25的易錯PCR文庫。

2.3重組釀酒酵母表達載體pYES-KanMX的構(gòu)建和重組釀酒酵母篩選根據(jù)質(zhì)粒pYES2.0酶切位點的特性，選擇G418基因的插入位點。引物Kan-F/Kan-R用于擴增G418基因，在正向引物中引入NheI的酶切位點，反向引物中引入NdeI的酶切位點。以質(zhì)粒pFA6a-GFPS65T-KanMX6為模板，PCR擴增G418抗性標(biāo)記基因，擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，構(gòu)建pMD18-KanMX。然后分別對pMD18-KanMX和pYES2.0進行NdeI/NheI雙酶切，凝膠回收基因片段并用T4連接酶連接。構(gòu)建表達載體pYES-KanMX質(zhì)粒，使pYES2.0的營養(yǎng)缺陷標(biāo)記改變?yōu)镚418抗性標(biāo)記。將spt15和taf25易錯PCR的片段經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，用T4連接酶連接經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶處理的表達載體pYES-KanMX，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5α，構(gòu)建表達載體的易錯PCR文庫。提取轉(zhuǎn)錄因子spt15和taf25易錯PCR表達載體突變文庫的質(zhì)粒，并用醋酸鋰的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的釀酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846，以含120μg/mLG418的YPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3d。將單菌落影印到新的含有120μg/mL的G418的YPD平板上。28℃培養(yǎng)3～5d。將pYES-KanMX空載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株，獲得酵母對照菌株。

2.4轉(zhuǎn)錄因子spt15和taf25突變基因轉(zhuǎn)化子的篩選和發(fā)酵性能研究將YPD-G418平板上生長的酵母菌落保存于YPD斜面培養(yǎng)基上，分別接種于O-medium，200r/min，28℃條件下培養(yǎng)48h后用HPLC的方法測定SAM含量。將獲得SAM產(chǎn)量高于對照的陽性重組子，按2%的接種量接種于500mL錐形瓶(內(nèi)有100mLO-mediun培養(yǎng)基)，控制起始的OD值一致，30℃、200r/min條件下培養(yǎng)。定時測定菌體OD600，繪制生長曲線，并測定發(fā)酵液中SAM的產(chǎn)量。SAM測定采用HPLC的方法，具體是1.0mL發(fā)酵液與2.0mL1.5mol/L高氯酸混勻，40℃反應(yīng)0.5h，8000g離心10min，取上清過0.45μm備用。SAM含量用HPLC測定，色譜條件:江蘇漢邦C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測波長254nm;流動相:0.1mol/L甲酸銨;體積流量:1.0mL/min;柱溫:40℃;進樣體積:10μL。2.5突變體的遺傳穩(wěn)定性研究突變體在YPD斜面?zhèn)鞔?8h轉(zhuǎn)接一次，共傳代5次，將傳代后的菌種進行生長和發(fā)酵試驗，并與原代的菌株進行比較，研究其SAM產(chǎn)量的傳代穩(wěn)定性。

3結(jié)果

3.1spt15和taf25基因的克隆以S.cerevisiaeCGMCC2846的基因組DNA為模板，利用設(shè)計的引物進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物電泳檢測在0.75kb左右(圖1)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后和克隆載體pMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，將陽性克隆進行基因序列測定，測序結(jié)果登陸NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對，結(jié)果表明得到的SPT15和TAF25基因的序列與數(shù)據(jù)庫中的基因序列同源性100%。

3.2spt15和taf25基因易錯PCR文庫的建立利用易錯PCR試劑盒以質(zhì)粒pMD18-SPT15和pMD18-TAF25為模板進行易錯PCR，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測易錯PCR產(chǎn)物與PCR產(chǎn)物基本相同(圖2)。將spt15和taf25易錯PCR的擴增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后用于構(gòu)建表達載體的易錯PCR文庫。