液晶生物傳感及其在微流控細(xì)胞分析中的應(yīng)用

　　摘 要: 液晶( LC) 生物傳感器是基于 LC 對界面性質(zhì)變化的高靈敏響應(yīng)及其固有的光學(xué)各向異性發(fā)展起來的一種技術(shù)，在生物樣品的檢測分析方面展現(xiàn)出了非凡的應(yīng)用價(jià)值。通過修飾刺激響應(yīng)性分子，LC 界面可以靈敏地響應(yīng)待測生物分析物的存在，并誘導(dǎo)界面 LC 分子發(fā)生取向改變，而界面上 LC 分子的短程相互作用引起 LC 相本體分子的取向改變，在偏光顯微鏡( POM) 下可見 LC 顯示出不同的光學(xué)織構(gòu)。因此，LC 傳感器無需對待測物進(jìn)行標(biāo)記，憑借其簡單的光學(xué)檢測儀器，容易將分子事件轉(zhuǎn)化為可視化光學(xué)信號輸出，具有簡單、靈敏、高效、快速、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，在生物檢測分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該文綜述了近年來液晶生物傳感器在檢測分析生物小分子、生物大分子以及生物有機(jī)體等方面的研究進(jìn)展，特別提到了液晶生物傳感器引入微流控芯片用于細(xì)胞分析的新興領(lǐng)域的發(fā)展與挑戰(zhàn)。目前，液晶生物傳感已經(jīng)成功地應(yīng)用于界面現(xiàn)象復(fù)雜多樣的細(xì)胞分析，未來就其在模擬細(xì)胞微環(huán)境下的傳感設(shè)計(jì)和適用性還需進(jìn)行更加深入的研究。

　　本文源自李瑋瑋，李雨軒，林金明 分析測試學(xué)報(bào) 2021 年 6 月 第 40 卷 第 6 期

　　關(guān)鍵詞: 液晶( LC) ; 生物傳感; 細(xì)胞分析; 微流控; 細(xì)胞微環(huán)境

　　液晶( Liquid crystal，LC) 是一種性質(zhì)介于固態(tài)和液態(tài)的物質(zhì)態(tài)，既具備晶體固體的各向異性，也具備液體的流動性[1]。一種固體材料在完全轉(zhuǎn)變?yōu)楦飨蛲缘囊合嘀埃赡芙?jīng)過一個或多個以分子取向?yàn)樘卣鞯闹虚g液晶相，相轉(zhuǎn)變過程或受溶劑的影響，或受熱過程的驅(qū)動，相應(yīng)的材料則被稱為溶致液晶和熱致液晶[2 - 3]。溶致液晶是當(dāng)兩親分子在有機(jī)或無機(jī)溶劑中的濃度達(dá)到一定范圍時(shí)，通過自組裝有序排列形成[4]。熱致液晶由棒狀或盤狀的各向異性分子組成，相變過程受溫度變化影響，僅在一定的溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)液晶性質(zhì)[5]。在 20 世紀(jì) 60 年代到 70 年代間，液晶科學(xué)得到迅速發(fā)展，期間液晶顯示技術(shù)的發(fā)展在很大程度上也推動了基礎(chǔ)和應(yīng)用研究[6]。液晶顯示器一般使用棒狀熱致液晶，LC 分子在一定強(qiáng)度的外加電場作用下發(fā)生取向變化。也就是說，由各向異性分子組成的液晶與外加場相互作用，強(qiáng)烈地改變自身的排列結(jié)構(gòu)。更令科學(xué)家感興趣的是，除了物理場之外，LC 對界面化學(xué)和生物物質(zhì)的變化也極為敏感。因此，近年來基于液晶化學(xué)/生物傳感器的研究取得了很大進(jìn)展，拓寬了液晶材料的應(yīng)用領(lǐng)域。液晶對界面的高靈敏響應(yīng)和固有的光學(xué)各向異性( 雙折射特性) 是液晶傳感分析化學(xué)/生物物質(zhì)的基礎(chǔ)[7]。生化分析物的刺激或界面附近發(fā)生生化反應(yīng)會影響 LC 分子間相互作用的力平衡，導(dǎo)致 LC 分子排列取向改變。在偏光顯微鏡( POM) 下，LC 分子的這種取向改變呈現(xiàn)出不同的偏光形貌。因此，液晶傳感分析消除了對標(biāo)記/標(biāo)簽的需求，可通過 LC 分子有效地放大生化信號的光學(xué)響應(yīng)。目前，已經(jīng)有許多綜述介紹了液晶傳感器在生物化學(xué)分析領(lǐng)域的應(yīng)用[8 - 10]。本綜述以近年來液晶生物傳感器在檢測生物小分子、生物大分子以及生物有機(jī)體( 病毒、細(xì)菌、細(xì)胞) 等方面的研究進(jìn)展為線索展開介紹，特別提到了其與微流控細(xì)胞芯片結(jié)合的新興領(lǐng)域的發(fā)展和挑戰(zhàn)。

　　1 生物小分子分析

　　液晶生物傳感器已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物小分子物質(zhì)的檢測分析，比如寡肽、磷脂、尿素、葡萄糖等。Bai 等[11]研究了二肽有序單分子膜上向列相液晶的取向有序性: 向列相液晶 5CB( 4-氰基-4'-戊基聯(lián)苯) 和 TL205( 含環(huán)己烷氟化聯(lián)苯和氟化三苯的介晶混合物) 在二肽有序單分子膜上的排列取向明顯受二肽的手性和磷酸化狀態(tài)的影響。上述屬于一種液晶 - 固體界面型的液晶生物傳感器，然而由于水對生物分子的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的保護(hù)作用，因此一些關(guān)于液晶和水相形成界面的研究為創(chuàng)建液晶 -水界面型的生物傳感器提供了新機(jī)會[12 - 13]。例如，Brake 等[12，14]研究了引入磷脂的液晶 - 水界面上 LC 分子的排列取向變化，在純液晶 - 水界面上，LC 分子傾向于平行于表面排列，即沿面排列( Planar) ，而磷脂的引入誘導(dǎo) LC 分子的取向變?yōu)榇姑媾帕? Homeotropic) ; 在含有酶負(fù)載液晶層的生物傳感器上引入含脂質(zhì)的水溶液可對酶促反應(yīng)進(jìn)行檢測，酶促反應(yīng)發(fā)生前，LC 分子由于磷脂的誘導(dǎo)作用在界面上呈垂面排列，隨著酶促反應(yīng)進(jìn)行，界面區(qū)域的脂質(zhì)被耗盡，LC 分子的取向變?yōu)槠矫媾帕?，對?yīng)酶促反應(yīng)進(jìn)程，在 POM 下可觀察液晶層呈現(xiàn)不同的偏光光學(xué)形貌。類似的這種平面薄膜型的液晶傳感器( 厚度通常為幾微米) ，通過功能化修飾還可實(shí)現(xiàn)對抗生素及其水解酶的高靈敏檢測[15]。

　　液晶分散在水相溶液中形成的 LC 液滴也是液晶 - 水界面型傳感器的一種重要形式，在液晶生物傳感領(lǐng)域發(fā)展迅猛[16]。相比薄膜型液晶傳感器，LC 液滴無需通過表面處理的固體基板來確定 LC 分子的初始排列方向，其分子的初始取向結(jié)構(gòu)由液滴界面的化學(xué)性質(zhì)決定[17]。目標(biāo)分析物吸附到 LC 液滴表面或在 LC 液滴附近發(fā)生反應(yīng)，觸發(fā) LC 表面錨定的變化，從而使液滴內(nèi) LC 分子呈現(xiàn)不同的排列取向[18 - 19]。Park 課題組[20 - 21]設(shè)計(jì)了一種聚( 丙烯酸-b-4-氰基聯(lián)苯-4'-十一烷基丙烯酸酯) ( PAA - b - LCP) 功能化的 5CB 液滴，并將脲酶或葡萄糖氧化酶共價(jià)固定在 PAA 鏈上，在 POM 下實(shí)現(xiàn)了對尿素和葡萄糖分子的高靈敏檢測。除了將 POM 作為觀測手段，Duan 等[22]將硬脂酸摻雜 5CB 微液滴作為傳感反應(yīng)器和光學(xué)諧振腔，結(jié)合回音壁模式( Whispering gallery mode，WGM) 激光技術(shù)，對生物小分子尿素進(jìn)行了高靈敏檢測( 圖 1) : 尿素和脲酶之間的酶促反應(yīng)產(chǎn)生氫氧根離子，導(dǎo)致水/液晶界面的硬脂酸脫質(zhì)子化和自組裝，誘導(dǎo)了 LC 分子的排列取向變化; WGM 激光光譜的可探測位移與 LC 分子的排列取向相關(guān)，指示酶促反應(yīng)進(jìn)程并實(shí)現(xiàn)了對尿素的定量檢測。

　　2 生物大分子分析

　　液晶生物傳感器在檢測分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子方面也有廣泛的應(yīng)用?；诒∧ば?LC 傳感器，Hu 等[23]設(shè)計(jì)了一種適配體靶向誘導(dǎo)解離輔助的功能性 LC 傳感方法，可同時(shí)檢測血液中多種腫瘤標(biāo)志物( 見圖 2) : 適配體 1( apt1) 修飾的磁珠( MBs) 特異性捕獲血液中的靶蛋白，靶蛋白包被的 MBs 與信號 DNA/apt2 共同孵育后，由于 apt2 對靶蛋白的特異性識別，在 MBs 上形成 apt1 /靶蛋白/apt2 三明治復(fù)合物，誘導(dǎo)信號 DNA 釋放; 信號 DNA 被負(fù)載互補(bǔ) DNA 的 LC 傳感器特異性識別，引起 LC 傳感器偏光形貌的改變。類似地，他們還通過原位 RCA 反應(yīng)放大腫瘤標(biāo)志物信號，在原位 RCA 產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到十八烷基三甲基溴化銨( OTAB) 修飾的 LC 界面后，液晶層的偏光形貌由暗變亮[24]。微流控技術(shù)在制備液滴型 LC 傳感器方面展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，制備的 LC 微液滴可用于生物大分子的特異性識別檢測。Khan 等[25]通過液滴微流控的方法制備了 PAA - b - LCP 功能化的 5CB 液滴: 與 LCP 嵌段緊密連接的 PAA 包覆在 5CB 液滴表面，通過共價(jià)偶聯(lián)對其進(jìn)行生物素化修飾，用于特異性檢測水/LC 界面上生物素( Biotin) —親和素( Avidin) 的特異性反應(yīng): 生物素和親和素在液滴表面特異性識別結(jié)合后，引起液滴表面電荷密度的改變，導(dǎo)致 5CB 液滴在 POM 下呈現(xiàn)從輻射( Radial，R) 到雙極( Bipolar，B) 的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，表明了功能化的 LC 液滴可通過配體 - 受體模型特定性地檢測蛋白質(zhì)或其他分析物。

　　3 生物有機(jī)體分析

　　LC 液晶傳感器在檢測細(xì)菌、病毒和細(xì)胞等有機(jī)體方面展現(xiàn)出了巨大的潛能。單分散的 5CB 液晶液滴可用于區(qū)分不同類型的細(xì)菌和病毒，接觸革蘭氏陰性( G - ) 細(xì)菌和脂膜病毒發(fā)生從 B 到 R 的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，而對G + 細(xì)菌和非脂膜病毒則不會發(fā)生織構(gòu)轉(zhuǎn)變[26]。上述織構(gòu)轉(zhuǎn)變被歸因于脂質(zhì)從生物體向 LC 液滴的轉(zhuǎn)移。LC 傳感器在細(xì)胞層面的應(yīng)用將有助于對細(xì)胞生命活動的探索，推動細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展。 Yoon 等[27]將與葉酸( FA) 配體共軛的聚( 苯乙烯-b-丙烯酸) 嵌段共聚物( PS - b - PAA) 修飾至 5CB 液晶液滴表面，LC 液滴上的葉酸配體與人口腔表皮樣癌細(xì)胞( KB) 的葉酸受體發(fā)生特異性相互作用，導(dǎo)致 LC 液滴發(fā)生 R - B 的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)了對 KB 細(xì)胞的特異性識別( 圖 3) 。該研究小組[28]進(jìn)一步設(shè)計(jì)了 β-半乳糖與 PS - b - PAA 共軛修飾的 5CB 液晶液滴，對肝癌細(xì)胞( HepG2) 的識別表現(xiàn)出了高度選擇性， HepG2 細(xì)胞與 β-半乳糖共軛的嵌段共聚物發(fā)生相互作用，有效地引起 LC 液滴發(fā)生 R - B 的織構(gòu)轉(zhuǎn)變，他們認(rèn)為嵌段共聚物的聚苯乙烯段將配體 - 受體的相互作用力從界面?zhèn)鬟f到 LC 液滴的內(nèi)部。但是以上用于細(xì)胞識別的 LC 液滴的尺寸與細(xì)胞的尺寸相當(dāng)，在檢測靈敏度上有待提高; 另外，為了維持 LC 液滴在水相介質(zhì)中的形貌，需加入表面活性劑十二烷基硫酸鈉( SDS) ，但 SDS 對細(xì)胞的毒害作用可能影響細(xì)胞活性。為了獲得更加靈敏的響應(yīng)和更好的生物相容性，Manna 等[29]將液晶 E7( 一種向列相液晶混合物，向列相的溫度范圍 TN = 10 ～ 60 ℃ ) 封裝在共價(jià)交聯(lián)的聚合物微膠囊中，實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞周圍介質(zhì)中是否存在對細(xì)胞有害的物質(zhì)，但未追蹤細(xì)胞釋放的分子或離子的動態(tài)變化。

　　4 微流控芯片細(xì)胞分析中的應(yīng)用

　　微流控芯片由于小型化、集成化等優(yōu)點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)與液晶傳感器的結(jié)合，在細(xì)胞分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。將液晶生物傳感器引入微流控細(xì)胞芯片是細(xì)胞分析前沿的一個嶄新領(lǐng)域。本課題組在與微流控細(xì)胞芯片結(jié)合的液晶生物傳感方面進(jìn)行了開發(fā)和研究: 如通過設(shè)計(jì)一種具有良好生物相容性的聚合物封裝的液晶微滴( P - E7PBA) ，可固定在微流控芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞表面高靈敏度、高選擇性地實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞/單細(xì)胞釋放的 NH3 [30]: 通過將摻雜 4-戊基聯(lián)苯-4'-羧酸( PBA) 的液晶 E7 封裝在聚電解質(zhì)層層自組裝的微膠囊中制備 P - E7PBA; 由于 P - E7PBA聚合物層外表面的氨基有利于其固定在負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面，固定在細(xì)胞膜上的 P - E7PBA響應(yīng)細(xì)胞釋放的 NH3，并引起自身表面電荷密度的改變，誘導(dǎo)了 LC 分子的排列取向變化，POM 下可觀察到 P - E7PBA從 R 到 B 的織構(gòu)轉(zhuǎn)變?？紤]到 P - E7PBA聚電解質(zhì)層層自組裝的制備耗時(shí)，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了可直接固定在微流控芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞表面的辣根過氧化物酶修飾的液晶彈性體微球( LCEM - HRP) ，以超高分辨率、選擇性監(jiān)測細(xì)胞釋放的 H2O2 ( 圖 4) [31]: LCEM - HRP 通過一種同心( Concentric，C) 向輻射( Radial，R) 的織構(gòu)轉(zhuǎn)變( C - R) 可視化實(shí)時(shí)報(bào)告細(xì)胞產(chǎn)生的 H2O2，這是由于 HRP 催化還原 H2O2 引起了微球的去質(zhì)子化和內(nèi)部鏈間/鏈內(nèi)氫鍵斷裂; 細(xì)胞表面的 LCEM - HRP 發(fā)生 C - R 織構(gòu)轉(zhuǎn)變的水平反映了細(xì)胞 H2O2 釋放量的差異，由此可探索細(xì)胞系和細(xì)胞 - 細(xì)胞的異質(zhì)性。

　　上述 P - E7PBA和 LCEM - HRP 引入的均為 2D 微流控細(xì)胞芯片，隨芯片內(nèi)微流體的層流流動，可直接固定在細(xì)胞表面對細(xì)胞釋放的分子進(jìn)行特異性的實(shí)時(shí)監(jiān)測，依托于微流控芯片的優(yōu)勢，該方法顯著減少了樣品試劑的用量和體積。微流控細(xì)胞芯片除了支持細(xì)胞培養(yǎng)，還可為體外細(xì)胞模擬/重構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境[32 - 33]。在模擬細(xì)胞微環(huán)境下，如機(jī)械應(yīng)力刺激、生化因子濃度梯度分布以及細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用等，通過集成的液晶生物傳感器實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞及其微環(huán)境變化的監(jiān)測，對細(xì)胞分析和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展具有重大意義。

　　然而，目前將液晶生物傳感器引入微流控細(xì)胞分析還是一個嶄新的領(lǐng)域，面臨著許多問題與挑戰(zhàn)。首先，微流控芯片允許進(jìn)行 2D/3D 細(xì)胞培養(yǎng)以及細(xì)胞微環(huán)境模擬，然而不同培養(yǎng)維度下細(xì)胞微環(huán)境在空間組織結(jié)構(gòu)、物質(zhì)傳輸方式、濃度梯度分布等方面存在差異性，要求設(shè)計(jì)適合不同細(xì)胞培養(yǎng)維度的液晶微傳感器以獲取真實(shí)的細(xì)胞生命活動信息。在 2D 靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)條件下，檢測以細(xì)胞作為唯一來源或者消耗的物質(zhì)濃度，與距離細(xì)胞的位置有直接關(guān)系，為了獲取接近細(xì)胞真實(shí)釋放或者消耗水平的定量檢測，有必要在細(xì)胞附近甚至是細(xì)胞表面引入一個位置明確的傳感器。能夠固定在細(xì)胞表面的液晶生物傳感器要求尺寸應(yīng)在幾微米，且具有良好的生物相容性和長時(shí)間的機(jī)械穩(wěn)定性，甚至可以在細(xì)胞表面以可控?cái)?shù)量和明確位置進(jìn)行精確固定，這需要進(jìn)一步研究方可實(shí)現(xiàn)。而 3D 細(xì)胞培養(yǎng)具有更加復(fù)雜的化學(xué)性和空間性，對引入其中的液晶生物傳感器在滿足 2D 細(xì)胞培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上提出了更高要求。例如，向一種廣泛使用的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型———多細(xì)胞微球中引入液晶生物傳感器以檢測細(xì)胞代謝物質(zhì)，而對于引入傳感器的位置和幾何形狀設(shè)計(jì)，以及代謝物質(zhì)向傳感器的運(yùn)輸方式等問題尚需進(jìn)行更深入的研究。此外，細(xì)胞界面現(xiàn)象的多樣性和復(fù)雜性，以及目標(biāo)生化分析物呈現(xiàn)的化學(xué)官能團(tuán)的多樣性和復(fù)雜性，不但增加了傳感設(shè)計(jì)的難度，也使得預(yù)測 LC 分子在含目標(biāo)分析物的界面上的排列取向成為一個亟待解決的特殊挑戰(zhàn)。

　　5 結(jié) 論

　　液晶傳感器具有的許多獨(dú)特優(yōu)勢，如對界面物理化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)敏感，容易通過化學(xué)修飾實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的特異性識別，無需對目標(biāo)生物分子進(jìn)行標(biāo)記，界面液晶分子的取向變化傳至液晶本體快速放大信號響應(yīng)，以及可實(shí)現(xiàn)小型化和生物相容性設(shè)計(jì)等，使其在生物傳感分析方面展現(xiàn)出了非凡的應(yīng)用價(jià)值。本文針對近年來液晶生物傳感器在檢測分析生物大/小分子和生物有機(jī)體等方面的研究進(jìn)展做了簡要綜述。此外，還特別介紹了新興領(lǐng)域———液晶生物傳感器引入微流控芯片細(xì)胞分析當(dāng)前的發(fā)展與面臨的挑戰(zhàn)?？傊?，目前液晶生物傳感器已發(fā)展到檢測分析細(xì)胞等生物有機(jī)體，然而就液晶傳感器的尺寸、穩(wěn)定性、特異性、生物相容性、傳感設(shè)計(jì)原理以及對不同細(xì)胞培養(yǎng)模型的適用性等諸多問題還值得進(jìn)行更加深入的設(shè)計(jì)與研究。