槲皮素對人骨髓瘤細(xì)胞U266侵襲和遷移的影響

　　[摘要] 目的 研究槲皮素對骨髓瘤細(xì)胞U266侵襲和遷移的影響及機(jī)制。

　　方法 用不同濃度的槲皮素處理人骨髓瘤細(xì)胞U266，噻唑藍(lán)(MTT)方法測定細(xì)胞存活變化，計算其半數(shù)抑制濃度。人骨髓瘤細(xì)胞U266分為空白對照組(不做藥物處理)、陽性對照組(用地西他濱處理)、槲皮素組(半數(shù)抑制濃度的槲皮素處理)、PDTC組(NF-κB信號抑制劑PDTC處理)、PDTC+槲皮素組(半數(shù)抑制濃度的槲皮素和PDTC處理)共5組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。各組以MTT檢測細(xì)胞存活能力，劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞運動能力，Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力，蛋白免疫印跡(Western blot)檢測細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、核因子-κBp65亞型(NF-κBp65)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白表達(dá)水平。

　　結(jié)果 槲皮素組、PDTC組、PDTC+槲皮素組細(xì)胞存活、侵襲、遷移能力及細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65表達(dá)水低于空白對照組(F=28.419～167.394，P<0.001)。PDTC+槲皮素組細(xì)胞存活、侵襲、遷移能力及細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65表達(dá)水平低于槲皮素組和PDTC組(P<0.05)。

　　結(jié)論 槲皮素能夠通過抑制NF-κB信號通路降低骨髓瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

　　[關(guān)鍵詞] 多發(fā)性骨髓瘤;槲皮素;腫瘤侵潤;腫瘤轉(zhuǎn)移;NF-κB

　　《中醫(yī)藥文化》創(chuàng)刊后始終以提高中醫(yī)工作者的古代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)閱讀和研究能力為辦刊宗旨。自1993年第三期始，本刊將學(xué)習(xí)和研究醫(yī)古文的著眼點，深深扎根于中華傳統(tǒng)文化的沃土之中，以弘揚中醫(yī)藥文化、普及中醫(yī)藥古代文獻(xiàn)知識為主，拓展視野。

　　骨髓瘤是一種惡性漿細(xì)胞增殖疾病，造血干細(xì)胞移植、新型藥物的應(yīng)用等大大提高了骨髓瘤病人的生存期，但是由于骨髓瘤具有易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移快等特點，尋找有效的骨髓瘤治療方法對病人預(yù)后具有重要意義[1]。槲皮素具有抗腫瘤活性，其可以抑制乳癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，但其具體的作用機(jī)制尚不明確[2-4]。核因子-κB(NF-κB)是一種在人體內(nèi)廣泛存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移等多種生理和病理過程，其在惡性腫瘤組織中過度激活，NF-κB抑制劑能夠下調(diào)腫瘤細(xì)胞的惡性表型[5-7]。相關(guān)研究顯示，槲皮素能夠下調(diào)肺癌等細(xì)胞中NF-κB的激活水平，槲皮素抗腫瘤活性可能與NF-κB信號通路抑制有關(guān)[8-9]。有研究結(jié)果顯示，槲皮素具有抗多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長的作用，槲皮素處理后的NCI-H929細(xì)

　　胞株的存活能力降低[10]。因此，本研究探討了槲皮素對骨髓瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響及其機(jī)制，旨在為延長骨髓瘤病人生存期提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　1.1.1 藥品、試劑和細(xì)胞 HRP標(biāo)記的二抗購自北京索萊寶科技有限公司，槲皮素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體購自美國Proteintech，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體購自美國Santa Cruz公司，NF-κB信號抑制劑PDTC購自美國Sigma公司，核因子-κBp65亞型(NF-κBp65)抗體購自美國Abbkine，人骨髓瘤細(xì)胞U266購自上海江林生物科技有限公司(細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)為：37 ℃，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱)。

　　1.1.2 重要儀器 SpectraMax iD3酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices，TE2000-U倒置顯微鏡購自日本尼康公司，TGL-18M離心機(jī)購自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，1658001垂直電泳槽購自美國Bio-Rad。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 噻唑藍(lán)(MTT)檢測槲皮素對骨髓瘤細(xì)胞存活影響 取生長至對數(shù)期的人骨髓瘤細(xì)胞U266，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化后，接種到96孔培養(yǎng)板中(接種密度為2×107/L，每孔添加100 μL)，放在37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在細(xì)胞中添加槲皮素，使槲皮素終濃度分別為0、40、80、160、320 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)板小心取出，添加20 μL的MTT，置于37 ℃結(jié)合4 h，棄上清液。添加二甲基亞砜溶液100 μL，放在振蕩器上反應(yīng)10 min，以酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的光密度(OD)值。經(jīng)空白孔調(diào)零以后，設(shè)置0 μmol/L作用組細(xì)胞存活率為100%，分析40、80、160、320 μmol/L濃度的槲皮素處理后細(xì)胞存活率變化。實驗設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

　　1.2.2 細(xì)胞分組 人骨髓瘤細(xì)胞U266依次分為：空白對照組(A組)、陽性對照組(B組)、槲皮素組(C組)以及PDTC組(D組)以及PDTC+槲皮素組(E組)共計5組。槲皮素組：采用含有槲皮素終濃度為130 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng);PDTC組：采用含有PDTC終濃度為50 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng);PDTC+槲皮素組：采用槲皮素終濃度為130 μmol/L和PDTC終濃度為50 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng);空白對照組：使用不添加槲皮素、地西他濱以及PDTC的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng);陽性對照組：在實驗0 h時用3.2 mmol/L的地西他濱細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。以MTT方法檢測各組細(xì)胞不同培養(yǎng)時間細(xì)胞存活率變化，步驟同1.2.1。

　　1.2.3 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力

　　在Transwell小室中添加RPMI 1640稀釋的濃度為100 mg/L的Matrigel，放在37 ℃濕化。取空白對照組、陽性對照組、槲皮素組、PDTC組、PDTC+槲皮素組細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液懸浮，在Transwell小室的上室內(nèi)添加105個細(xì)胞(200 μL)，分別在下室中添加600 μL的含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，放在37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將小室取出，用棉簽擦掉沒有穿膜的細(xì)胞。甲醇固定，吉姆薩染色，光鏡下選取5個視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目。Transwell小室細(xì)胞遷移實驗同侵襲實驗，遷移實驗前不用Matrigel濕化。實驗設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

　　1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65蛋白表達(dá) 空白對照組、陽性對照組、槲皮素組、PDTC組、PDTC+槲皮素組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)24 h，用常規(guī)方法分別提取細(xì)胞中的總蛋白，蛋白樣品保存在-80 ℃。SDS-PAGE電泳后在冰上轉(zhuǎn)膜70 min。將電轉(zhuǎn)后的NC膜取出，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05牛血清清蛋白的封閉液中孵育結(jié)合2.0 h。NC膜再與MMP-2、MMP-9、NF-κBp65抗體稀釋液在4 ℃過夜反應(yīng)以后，與HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)2.0 h，以ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光。用Quantity One軟件掃描分析MMP-2、MMP-9、NF-κBp65條帶和內(nèi)參β-actin條帶的灰度值，分析目的條帶表達(dá)水平。MMP-2、MMP-9、NF-κBp65抗體分別以1∶600、1∶600、1∶400稀釋，HRP標(biāo)記的二抗以1∶4 000稀釋。