南海珊瑚來(lái)源真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 的分離鑒定及其次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

　　摘要：【目的】南海珊瑚共附生真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 次級(jí)代謝產(chǎn)物分離鑒定及抑菌活性篩選。【方法】利用稀釋涂布平板法分離珊瑚共附生真菌。采用單菌多代謝產(chǎn)物方法(One strain many compounds, OSMAC)對(duì)分離菌株進(jìn)行化學(xué)多樣性篩選，并采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)真菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性分析。通過(guò) ITS 測(cè)序鑒定活性菌株 SCSIO 40435 的分類(lèi)地位，運(yùn)用多種色譜手段從其粗提物中分離純化單體化合物，并利用各種波譜手段(HRESIMS、1D 和 2D NMR、單晶 X-ray 衍射法等)確定化合物的結(jié)構(gòu)。最后，采用微量肉湯稀釋法對(duì)單體化合物的抑菌活性進(jìn)行評(píng)估。【結(jié)果】從南海珊瑚樣品中分離得到 19 株共附生真菌，結(jié)合化學(xué)多樣性和抑菌活性分析，篩選出一株產(chǎn)物豐富且具有多種抑菌活性的菌株 SCSIO 40435。利用 ITS 測(cè)序分析將其鑒定為曲霉屬真菌(Aspergillus sp.)，進(jìn)一步從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了 4 個(gè)對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)化合物：dicandidusin A(1)、candidusin A(2)、 terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)，其中化合物 1 為一個(gè)對(duì)三聯(lián)苯同源二聚體類(lèi)新化合物。此外，首次對(duì)化合物 4 的單晶結(jié)構(gòu)進(jìn)行了報(bào)道。【結(jié)論】本研究表明南海珊瑚中含有豐富的共附生真菌資源，且具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力，有望成為藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。

　　關(guān)鍵詞：珊瑚共附生真菌;活性次級(jí)代謝產(chǎn)物;對(duì)三聯(lián)苯二聚體

　　葉偉霞; 趙夢(mèng)冉; 王璐; 蔣曉東; 張文軍; 張長(zhǎng)生; 田海妍， 微生物學(xué)報(bào) 發(fā)表時(shí)間：2021-11-25

　　南海海域遼闊，生物資源種類(lèi)繁多，是我國(guó)最重要的海島和珊瑚礁、紅樹(shù)林、海草床等生態(tài)系統(tǒng)分布區(qū)，也是全球海域生物多樣性最高的地區(qū)之一[1]。珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是由生物和非生物構(gòu)建的復(fù)雜、獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)，是海洋中的“熱帶雨林”。珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)除為種類(lèi)繁多的動(dòng)植物提供棲息場(chǎng)所外還共附生著豐富的微生物種群[2]。這些微生物長(zhǎng)期處于極端的生境下(高壓、高鹽度、寡營(yíng)養(yǎng)、低溫、黑暗等)，寄生或共生于宿主之中，從而與宿主之間產(chǎn)生特殊的交流方式[3-4]。這種相互關(guān)系往往使共附生微生物進(jìn)化出獨(dú)特的代謝途徑和防御體制，具有產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)的潛能[5-6]。近年來(lái)，研究人員逐漸把目光從珊瑚礁的生態(tài)學(xué)意義、珊瑚微生物群的特征等研究領(lǐng)域轉(zhuǎn)向珊瑚共附生真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)掘上，并取得了巨大進(jìn)展。目前，從珊瑚共附生真菌中獲得的活性物質(zhì)種類(lèi)多樣，Wang 等從珊瑚共附生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到具有新穎結(jié)構(gòu)的硫代甘油酸酯取代的骨架重排混元二萜類(lèi)化合物 Alternarin A，該化合物有顯著的神經(jīng)藥理活性[7]。Cao 等以二級(jí) MS 為指導(dǎo)從珊瑚來(lái)源的真菌中分離得到 4 個(gè)新穎的 7 元環(huán)肽，并半合成了一系列環(huán)七肽衍生物，其合成衍生物顯示出中等強(qiáng)度的抗結(jié)核桿菌活性[8]。Cheng 等從珊瑚來(lái)源真菌中分離得到新穎的三元螺環(huán)橘霉素衍生物[9]。至今已從珊瑚來(lái)源真菌中分離得到萜類(lèi)、聚酮、肽類(lèi)、蒽醌類(lèi)以及生物堿等多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型天然產(chǎn)物，這些天然產(chǎn)物呈現(xiàn)出抗癲癇、抗病毒、抗結(jié)核、抗炎以及抗腫瘤等多種生物活性[10-13]，珊瑚來(lái)源真菌已經(jīng)成為當(dāng)前最具開(kāi)發(fā)前景的天然產(chǎn)物新藥源之一。

　　近期，我們從南海來(lái)源珊瑚中篩選出 1 株產(chǎn)物豐富且具有多種抑菌活性的真菌 SCSIO 40435，結(jié)合 ITS 測(cè)序鑒定為曲霉屬真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435，進(jìn)一步從其大米培養(yǎng)物中分離鑒定了 4 個(gè)對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)化合物(1-4, 圖 1)。結(jié)合 HRESIMS、1D 和 2D NMR、X-ray 單晶衍射等波譜數(shù)據(jù)，確定化合物 dicandidusin A(1)為新的對(duì)三聯(lián)苯同源二聚體，2-4 為已知化合物，分別為 candidusin A(2)、terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)。本文報(bào)道曲霉屬真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 的分離篩選及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離鑒定與活性評(píng)價(jià)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 樣品來(lái)源

　　供試珊瑚由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所蔣曉東博士采集于中國(guó)南海，樣品采集后立即放置于無(wú)菌塑料樣品袋中，保存于 4 °C，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后用于真菌的分離。

　　1.1.2 培養(yǎng)基

　　(1)菌株分離固體培養(yǎng)基

　　PDA 培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖水 24 g，瓊脂粉 20 g，海鹽 30 g。GPSA 培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10g，細(xì)菌學(xué)蛋白胨 1 g，可溶性淀粉 10 g，K2HPO4 10 g，MgSO4 1 g，瓊脂粉 20 g，海鹽 30 g，pH 7.0~7.4。甘油-酪素培養(yǎng)基(g/L)：甘油 10 g，酪蛋白胨 10 g，KNO3 2 g，NaCl 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4•7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4•7H2O 0.01 g，CaCO3 0.2 g，瓊脂粉 20 g，海鹽 30 g，pH 7.0~7.4。

　　(2)菌株發(fā)酵篩選培養(yǎng)基

　　PDB 培養(yǎng)基(g / L)：馬鈴薯葡萄糖水 24 g，海鹽 30 g。大米培養(yǎng)基：大米 10 g，海鹽 0.45 g，蒸餾水 15 mL。小米培養(yǎng)基：小米 10 g，海鹽 0.45 g，蒸餾水 15 mL。燕麥培養(yǎng)基：燕麥 10 g，海鹽 0.6 g，蒸餾水 20 mL。

　　(2)抑菌活性篩選培養(yǎng)基

　　LB 培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，調(diào) pH 7.0。 MH 培養(yǎng)基(g/L)：水解酪蛋白胨肉湯 21 g。

　　1.1.3 指示菌種類(lèi)

　　測(cè)試病原菌包括：大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 1064)，鮑曼不動(dòng)桿菌( Acinetobacter baumannii ATCC 19606 ) ， 耐 甲 氧 西 林 金 黃 色 葡 萄 球 菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)。

　　1.1.4 主要試劑和儀器

　　PCR 擴(kuò)增儀(Thermo Fisher Scientific ABI Veriti 96 well 型，德國(guó) Eppendorf 公司);多功能組合式搖床(HYG-C，太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker AVANCE 700M 型，德國(guó) Bruker 公司);高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜(Bruker maXis，德國(guó) Bruker 公司);柱色譜硅膠(100~200 目，煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)，硅膠薄層板(HS-GF 254，煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國(guó) Agilent 公司);半制備高效液相色譜儀(Hitachi Primaide，日本日立公司);色譜柱(Phenomenex ODS column 250 mm × 10.0 mm, 5 μm; Phenomenex, USA);培養(yǎng)箱(MJ01，湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司)。試劑：色譜純乙腈(安徽時(shí)聯(lián)公司);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

　　1.2 真菌的分離和純化

　　將采集到的樣品置于超凈臺(tái)中，用經(jīng) 75%乙醇消毒的剪刀剪取珊瑚樣品約 10 g，置于裝有已滅菌人工海水的燒杯中，對(duì)其表面進(jìn)行清洗，用已滅菌的攪拌機(jī)將樣品充分碾碎，得組織原液。隨后將原液稀釋至 10-1、10-2，用移液槍吸取 200 μL 加到分離培養(yǎng)基的平板上，用一次性涂布棒涂布均勻，吹干后置于 28 ?C 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 7~30 d，每隔 3 d 左右觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。所有長(zhǎng)出的真菌菌落均接種于 PDA 平板上，并多次純化直至獲得純的菌株。

　　1.3 菌株發(fā)酵篩選及活性測(cè)試

　　將分離得到的真菌菌株接種至 PDB 液體培養(yǎng)基中(50 mL/250 mL)，28 °C，200 r/min 振蕩培養(yǎng) 2 d 作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液，將生長(zhǎng)良好的種子液以 10%(V/V)的接種量接種至 3 種固體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng) 30 d。收菌后以體積比(V/V)1:1 加入丁酮浸泡提取、旋干，提取物均分成兩份。一份用甲醇溶解，HPLC 進(jìn)樣檢測(cè);另一份提取物加 DMSO 配成 20 mg/mL 的溶液，并采用濾紙片擴(kuò)散法[14]進(jìn)行抑菌活性篩選。

　　1.4 真菌 SCSIO 40435 的菌種鑒定

　　1.4.1 真菌基因組 DNA 提取及 ITS 基因序列擴(kuò)增

　　利用真菌基因組 DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組 DNA，以通用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)菌株 ITS 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為 20 μL：dd H2O 13 μL，DNA 模板 0.5 μL，dNTPs 1.2 μL，5 × FastPfu 緩沖液 4 μL，F(xiàn)astPfu 酶 0.4 μL，ITS1 引物 0.5 μL，ITS4 引物 0.5 μL。PCR 程序?yàn)椋?5 °C 5 min;95 °C 40 s，55 °C 35 s，72 °C 1 min，30 個(gè)循環(huán);72 °C 10 min。PCR 產(chǎn)物由廣州擎科生物技術(shù)有限公司回收純化，完成測(cè)序。

　　1.4.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

　　利用軟件 SeqMan 將測(cè)序得到的序列結(jié)果進(jìn)行校對(duì)拼接，將拼接得到的完整序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，選擇同源性較高且具有代表性的真菌作為參考序列，下載相應(yīng)菌株的序列和信息。使用軟件 MEGA-X 以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[15 -17]。

　　1.5 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 大規(guī)模固體發(fā)酵與萃取

　　將菌株 Aspergillus sp. SCSIO 40435 接種至 PDB 液體培養(yǎng)基中(50 mL/250 mL)，28 °C， 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 2 d 作為放大發(fā)酵培養(yǎng)的種子液，將生長(zhǎng)良好的種子液以 20%(V/V)的接種量接種至 15 kg 大米固體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng) 30 d。收集菌體以體積比(V/V)1:2 加入丙酮浸泡提取 3 次，減壓濃縮回收丙酮。將 3 次濃縮浸膏合并，水混旋，乙酸乙酯萃取 3 次，經(jīng)減壓濃縮后獲得 118 g 粗浸膏。

　　1.6 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取分離

　　乙酸乙酯萃取部位(118 g)，經(jīng)硅膠柱色譜梯度洗脫(氯仿-甲醇：100/0, 95/5, 90/10, 85/15, 70/30, 50/50, 0/100)，通過(guò)薄層色譜法(TLC)檢識(shí)，結(jié)合 HPLC 分析檢測(cè)合并得餾分 Fr. 1 ~ Fr. 4。其中 Fr. 1 經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(100/0, 5/1, 4/1, 7/3, 6/4, 5/5, 3/7, 2/8, 0/100)以及乙酸乙酯/甲醇(100/0, 7/3, 5/5, 3/7, 0/100)梯度洗脫，經(jīng) TLC 及 HPLC 分析合并得 11 個(gè)子餾分 Fr.1-A ~ Fr. 1-K，其中 Fr.1-F 經(jīng)反相中壓色譜(ODS)，采用乙腈/水體系(A 相： 0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)梯度洗脫(VB : VA = 5 : 95~95 : 5，流速 10 mL/min)得到 20 個(gè)餾分 Fr. 1-F-01– Fr. 1-F-20。Fr.1-F-08 經(jīng)凝膠色譜(Sephadex LH-20)，采用氯仿/ 甲醇(1:1)體系得到 4 個(gè)餾分 Fr.1-F-08-L1 – Fr.1-F-08-L4，其中 Fr.1-F-08-L4 經(jīng)半制備液相，以乙腈/水體系(A 相：0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)梯度洗脫(0~15 min, 50% B 相;15~25 min, 50%~70% B 相; 25.1~33 min, 100% B 相)得到化合物 1(2.9 mg)和化合物 2(46.1 mg)。Fr.1-F-08-L3 經(jīng)半制備液相，以乙腈/水體系(A 相：0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)等度洗脫(VB : VA = 50 : 50)得到化合物 3(25.2 mg)。將餾分 Fr.1-D 通過(guò)重結(jié)晶法，純化得到化合物 4(41.0 mg)。化合物 1-4 結(jié)構(gòu)如圖 1。

　　1.7 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性評(píng)價(jià)

　　采用微量肉湯稀釋法[18]測(cè)定化合物 1-4 的最小抑菌濃度(MIC)。將化合物以 DMSO 為溶劑配成終濃度為 2.56 mg/mL 的母液，-20 °C 保藏備用。在 96 孔板上第 1 列的每孔加入 MH 液體培養(yǎng)基 200 μL，第 2 列的每孔加入 MH 液體培養(yǎng)基 100 μL，第 3 列加入 190 μL MH 液體培養(yǎng)基，其余每列加入 MH 液體培養(yǎng)基 100 μL。然后在第 3 列每孔加入樣品母液 10 μL，吹吸混勻，再?gòu)牡?3 列吸取 100 μL 液體到第 4 列，吹吸混勻，同理依次往下 2 倍稀釋到第 12 列，最后 1 列取 100 μL 棄去。按照同樣的方法分別加入 DMSO 和環(huán)丙沙星作為對(duì)照組。

　　用無(wú)菌的 MH 液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)好的菌液稀釋 1000 倍，除第 1 列外每孔加入稀釋菌液 100 μL，使化合物的終濃度分別為 64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 μg/mL。以上實(shí)驗(yàn)每組做 3 個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)。16 h 后觀察菌株生長(zhǎng)情況，按照 CLSI 中“甲氧芐胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法”的終點(diǎn)判斷，與陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照管比較，抑制 80%細(xì)菌生長(zhǎng)管藥物濃度為受試菌 MIC。

　　2 結(jié)果和分析

　　2.1 菌株的分離鑒定與篩選

　　對(duì)分離獲得的 19 株真菌分別采用 3 種不同的固體培養(yǎng)基(大米、小米及燕麥培養(yǎng)基)培養(yǎng)，通過(guò) HPLC-DAD 檢測(cè)樣品的化學(xué)多樣性，通過(guò)紙片法篩選抑菌活性，發(fā)現(xiàn)菌株 SCSIO 40435 的次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富(圖 2)，且對(duì) 4 種革蘭氏陽(yáng)性菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 1064)，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)均具有抑制作用，其中對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的抑菌作用較強(qiáng)(表 1)。將菌株 SCSIO 40435 的 ITS 測(cè)序結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，并下載同源性較高的序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析(圖 3)，發(fā)現(xiàn)菌株 SCSIO 40435 的 ITS 序列與 Aspergillus candidus(MT524443.1)的相似性最高，以 100%可信度聚在一個(gè)分支。綜合以上分析結(jié)果，將菌株鑒定為 Aspergillus sp. SCSIO 40435。

　　2.2 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中化合物結(jié)構(gòu)鑒定

　　通過(guò)大米固體培養(yǎng)基對(duì)真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 進(jìn)行放大發(fā)酵，從中分離得到 4 個(gè)對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)化合物：dicandidusin A(1)、candidusin A(2)、terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)，其中化合物 1 為對(duì)三聯(lián)苯同源二聚體新化合物。

　　2.2.1 新化合物結(jié)構(gòu)解析

　　化合物 1 為灰褐色無(wú)定形固體，正離子高分辨電噴霧質(zhì)譜(HRESIMS)顯示其準(zhǔn)分子離子峰為 m/z 703.1786 [M + H]+(C40H31O12 計(jì)算值為 703.1810)，不飽和度為 26。分析化合物 1 的 1H、13C NMR 以及 HSQC 數(shù)據(jù)(表 2，圖 S1)發(fā)現(xiàn)有 2 個(gè)氧甲基、6 個(gè) sp2 雜化的次甲基、12 個(gè)季碳和 3 個(gè)活潑質(zhì)子信號(hào)，僅為元素組成信號(hào)的一半，提示化合物 1 可能是同源二聚體。對(duì)其核磁數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)化合物 1 的核磁數(shù)據(jù)與已知化合物 Candidusin A(2)的核磁數(shù)據(jù)高度相似，不同之處在于化合物 1 比 2 少了一個(gè) sp2 雜化的次甲基(δH 6.76, H-17; δC 114.8, C-17)，推測(cè) 1 通過(guò) C-17/C-17′相連。由于 1 中三個(gè)活潑質(zhì)子信號(hào)位于同一處，因此無(wú)法利用 HMBC 相關(guān)(圖 S1)判斷二聚體的連接位置。分析 1 的 NOESY 相關(guān)，發(fā)現(xiàn) H-5、H-14 與 H3-20 有相關(guān)(圖 4-A，圖 S1)，表明化合物 1 中兩個(gè) sp2 雜化的次甲基分別位于 C-14(δH, 7.29; δC, 102.4)及 C-5 位(δH, 6.63; δC, 105.1)，進(jìn)而證實(shí)化合物 1 的 2 個(gè)單體通過(guò) C-17/C-17′相連，進(jìn)一步詳細(xì)地歸屬 1 的核磁信號(hào)確證了平面結(jié)構(gòu)。化合物 1 的 D 環(huán)與 D′環(huán)之間的聯(lián)苯鍵可能具有軸手性，對(duì)化合物 1 的旋光值進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其旋光值近乎為零(-0.0007°)，[α]D 25 -2 (c 0.025, MeOH)，推測(cè)其為外消旋體。鑒于化合物 1 的含量較少，未對(duì)其進(jìn)行手性拆分。最后，我們推測(cè)了化合物 1 的生物合成機(jī)理(圖 4-B)：化合物 1 的生物合成起源于酪氨酸，在生物體內(nèi)酪氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶的作用轉(zhuǎn)化為 4-羥基苯丙酮酸，兩個(gè) 4- 羥基苯丙酮酸縮合，生成對(duì)三聯(lián)苯前體，經(jīng)烯醇互變、還原、脫水等形成對(duì)三聯(lián)苯單體化合物 2 [19]，化合物 2 可能在 P450 氧化酶的催化下形成自由基化合物 2a，兩個(gè) 2a 發(fā)生自由基偶合、烯醇互變形成化合物 1 [20]。已報(bào)道的 P450 氧化酚羥基引發(fā)的自由基偶合反應(yīng)多數(shù)發(fā)于分子內(nèi)、形成分子內(nèi)的 C-C 鍵，分子間的、能形成具有軸手性的聯(lián)苯鍵自由基偶合反應(yīng)也有報(bào)道，但相對(duì)較少[20]。

　　2.2.2 已知化合結(jié)構(gòu)鑒定

　　Candidusin A(2):灰褐色固體，HRESIMS m/z [M + H]+ 353.1028 (C20H17O6 計(jì)算值 353.1020)。1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.37 (3H, s, 10-OH/15-OH/16-OH), 7.42 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-8/12), 7.38 (1H, s, H-14), 7.08 (1H, s, H-17), 6.86 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-9/11), 6.70 (1H, s, H-5), 3.97 (3H, s, 20-OCH3), 3.75 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 157.1 (C-10), 149.9 (C-18), 149.8 (C-4), 148.9 (C-2), 146.3 (C-16), 143.0 (C-15), 136.4 (C-1), 131.0 (C-6), 130.8 (C-8/C-12), 129.1 (C-7), 115.6 (C-9/C-11), 114.5 (C-3), 114.1 (C-14), 107.5 (C-5), 106.0 (C-13), 99.0 (C-17), 61.0 (C-20), 56.3 (C-19)。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致。 Terphenyllin(3):白色固體，HRESIMS m/z [M + H]+ 339.1226 (C20H19O5計(jì)算值 339.1227)。 1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.58 (1H, s, 10-OH), 9.34 (1H, s, 16-OH), 8.51 (1H, s, 2-OH), 7.44 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-8/12), 7.10 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-14/18), 6.85 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-9/11), 6.76 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-15/17), 6.39 (1H, s, H-5), 3.64 (3H, s, 20-OCH3), 3.29 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 157.2 (C-16), 156.3 (C-10), 153.5 (C-4), 148.6 (C-2), 139.7 (C-1), 132.8 (C-6), 132.3 (C-14/C-18), 130.2 (C-8/C-12), 129.2 (C-7), 125.0 (C-13), 117.3 (C-3), 115.6 (C-9/C-11), 114.8 (C-15/C-17), 103.4 (C-5), 60.5 (C-20), 56.0 (C-19)。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致。

　　4"-deoxyterphenyllin(4): 白色固體，HRESIMS m/z [M + H]+ 323.1285 (C20H18O4 計(jì)算值 323.1278)。1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.33 (1H, s, 16-OH), 8.61 (1H, s, 2-OH), 7.62 (2H, dt, J = 7.0, 1.3 Hz, H-8/12), 7.47 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-9/11), 7.38 (H, tt, J = 7.4, 1.2 Hz, H-10), 7.12 (2H, dt, J = 8.5, 2.0 Hz, H-14/18), 6.78 (2H, dt, J = 8.5, 2.0 Hz, H-15/17), 6.45 (1H, s, H-5), 3.64 (3H, s, 20-OCH3), 3.30 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 156.5(C-16), 153.6 (C-4), 148.7 (C-2), 139.9 (C-10), 138.7 (C-1), 132.9 (C-6), 132.3 (C-14/C-18), 129.1 (C-8/C-12), 127.7 (C-7), 124.9 (C-13), 118.2 (C-3), 128.8 (C-9/C-11), 114.8 (C-15/C-17), 103.7 (C-5), 60.8 (C-20), 56.1 (C-19)。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致。 Crystal data of 4"-deoxyterphenyllin(4):三斜晶系，空間群 P-1 (no. 2)，晶體大小為 0.01 mm × 0.01 mm × 0.01 mm;晶胞參數(shù)：a = 8.9333 (7) Å, b = 9.8055 (8) Å, c = 10.2676 (10) Å, α = 85.119 (7)°, β = 65.971 (9)°, γ = 72.469 (7)°, 晶胞體積 V = 782.57 (13) Å3, Z = 2, 計(jì)算密度 1.368 g/cm3，Cu-Kα 輻射( λ = 1.54184 Å );收集總衍射點(diǎn) 7224，獨(dú)立衍射點(diǎn) 3050;R1 = 0.0466，wR2 = 0.1487。該晶體數(shù)據(jù)已上傳至劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CCDC - 2116133)。

　　2.3 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中化合物抑菌活性實(shí)驗(yàn)

　　采用微量肉湯稀釋法[18]評(píng)估了化合物 1-4 對(duì) 2 株革蘭氏陰性致病菌(大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)和鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606))和 4 株革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 1064)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01))的抑菌活性。結(jié)果表明(表 3)化合物 1 對(duì) 6 株致病菌無(wú)明顯抑制活性，MIC 均大于 64 μg/mL。化合物 2 和 3 對(duì)革蘭氏陰性的大腸桿菌具有顯著生長(zhǎng)抑制活性，MIC 分別為 1 μg/mL 和 0.5 μg/mL，其中化合物 2 對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌有生長(zhǎng)抑制活性，MIC 為 64 μg/mL。此外，化合物 2 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也表現(xiàn)出中等強(qiáng)度生長(zhǎng)抑制活性， MIC 分別為 32 μg/mL 和 16 μg/mL;但其對(duì)枯草芽孢桿菌及藤黃微球菌無(wú)明顯抑制作用， MIC 大于 64 μg/mL。不同的是，化合物 4 對(duì)枯草芽孢桿菌及藤黃微球菌則表現(xiàn)出一定的抑制作用，其 MIC 分別為 64 μg/mL 和 32 μg/mL，而對(duì)其它 4 株指示菌無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制活性， MIC 大于 64 μg/mL。

　　3 討論

　　珊瑚等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，蘊(yùn)含著大量的共附生微生物資源。曲霉屬真菌不僅是海洋常見(jiàn)真菌種屬之一，也是活性次級(jí)代謝產(chǎn)物主要產(chǎn)生菌[23]。迄今為止，從海洋來(lái)源曲霉屬真菌中已發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如生物堿[24]、聚酮[25]、萜類(lèi)[26]、蒽醌類(lèi)[27]、異香豆素類(lèi)[28]、肽類(lèi)[29]和對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)[30]等。Terphenyllin 是最先發(fā)現(xiàn)的對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)化合物，由 C Takahashi 等[31]在 1976 年分離于 Aspergillus candidus。此外，2016 年 Lars Andernach 等[32]從菌株 Allantophomopsis lycopodina 中分離獲得對(duì)三聯(lián)苯與萘并呋喃三聯(lián)苯的二聚體 allantonaphthofuran A-C。至今，已報(bào)道的對(duì)三聯(lián)苯衍生物已超過(guò) 230 個(gè)[33]，但對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)化合物二聚體鮮有報(bào)道。對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)衍生物具有多種生物活性，如神經(jīng)氨酸酶抑制、α-葡萄糖苷酶抑制、抗氧化、細(xì)胞毒性、抗菌和免疫抑制活性[33-34]。本文對(duì)化合物 1-4 的抑菌活性進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)已知化合物 2 不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用(16 μg/mL)微強(qiáng)于金黃色葡萄球菌(32 μg/mL)，還對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，MIC 達(dá)到 1 μg/mL。此外，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌也表現(xiàn)出微弱的抑制活性(64 μg/mL)，為潛在的抗菌藥物先導(dǎo)化合物。遺憾的是，其同源二聚體化合物 1 并沒(méi)有觀察到明顯的抑菌活性。

　　綜上所述，本研究通過(guò)化學(xué)多樣性與抗菌活性分析，從南海珊瑚中篩選了一株真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物分離，從中鑒定了4個(gè)對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)化合物(1-4)，其中化合物 dicandidusin A(1)為首次報(bào)道的新穎對(duì)三聯(lián)苯化合物同源二聚體。本研究還對(duì) 4 個(gè)單體化合物進(jìn)行了抗菌活性評(píng)估，結(jié)果顯示已知化合物 2 的抑菌活性明顯強(qiáng)于化合物 3 和 4，推測(cè)化合物 2 中形成的呋喃環(huán)單元可能對(duì)抑菌活性發(fā)揮重要作用。但其同源二聚體化合物 1 無(wú)明顯抑菌活性，因此，關(guān)于其具體活性作用機(jī)理的研究，還有待進(jìn)一步探索。本研究不僅豐富了現(xiàn)有對(duì)三聯(lián)苯類(lèi)化合物的多樣性，而且為后續(xù)利用珊瑚來(lái)源的真菌生產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。