綠豆皮中黃酮類化合物的抗氧化活性及其結(jié)構(gòu)分析

　　摘　要：本文旨在分析綠豆皮中黃酮類化合物的抗氧化活性及其結(jié)構(gòu)。采用 20%、40%、60%、80% 乙醇對綠豆皮黃酮粗提物進(jìn)行梯度洗脫純化，以總抗氧化能力(total antioxidative capability, T-AOC)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、2，2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2，2′- azinobis-3-ethylbenzothia zoline-6-sulphonic acid，ABTS)自由基清除能力、羥自由基清除能力等為指標(biāo)，篩選出具有最高抗氧化活性的組分，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明，60% 洗脫液中綠豆皮黃酮的抗氧化能力最強(qiáng)，其 DPPH 自由基清除能力為 48.03%;ABTS 自由基清除能力為 57.53%;羥自由基清除能力為 12.02%;T-AOC 的抗氧化活性為 207.64 U/mL，顯著高于其他洗脫液(P<0.05)。綠豆皮中具有最強(qiáng)抗氧化活性的黃酮類化合物分別包括牡荊素 (vitexin)、異牡荊素 (isovitexin) 及圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷 (eriodictyol-6-C-β-D-glucopyranoside)。

　　關(guān)鍵詞：綠豆皮，黃酮類化合物，抗氧化活性，結(jié)構(gòu)分析

　　陳洪生國慧刁靜靜等-《食品工業(yè)科技》2022年

　　綠豆(Vigna radiata)是一種藥食同源的食用豆，其富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素，還含有豐富的多酚、酚酸和黃酮類化合物等活性成分，這些活性成分由于其較強(qiáng)的抗氧化能力而有利于預(yù)防癌癥、糖尿病、心血管疾病等非傳染性慢性病[1−2]。我國在對綠豆進(jìn)行工業(yè)利用過程中會(huì)產(chǎn)生大量綠豆皮，這些綠豆皮多被用作動(dòng)物飼料或者直接廢棄物[3]。綠豆皮中含有大量的黃酮類、多酚類化合物，這些功效成分具有抗腫瘤[4]、降低血脂、降膽固醇等生理功能[5]。因此，綠豆皮可以用來制取黃酮類物質(zhì)，以提高資源利用率。近年來，國內(nèi)外有關(guān)綠豆皮的研究主要集中在功能成分的制取及營養(yǎng)功效評價(jià)，朱文學(xué)等[6] 采用超聲波輔助水提取綠豆皮黃酮工藝的研究;Yao 等和 Peng 等[4,7] 的研究發(fā)現(xiàn)綠豆中富含多酚，這些酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的 DPPH 自由基清除能力。Lee 等[8] 研究發(fā)現(xiàn)綠豆皮提取物黃酮具有抗炎作用。羅磊等[9] 研究表明綠豆皮黃酮對氧化損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。以上這些研究都證實(shí)綠豆皮黃酮具有較好的抗氧化、抗炎等生物活性，但綠豆皮黃酮類物質(zhì)中起主要作用的活性組分的具體組成，目前還不甚清楚。

　　本試驗(yàn)采用自主研制的連續(xù)化制備色譜對綠豆皮黃酮粗提物進(jìn)行梯度分離，收集不同分級產(chǎn)物分析其抗氧化能力，采用 LC-MS 分析具有最強(qiáng)抗氧化能力級分的結(jié)構(gòu)，以得出綠豆皮黃酮中最強(qiáng)抗氧化活性的組分結(jié)構(gòu)，以期為綠豆皮的高值化利用提供理論支撐。

　　1　材料與方法 1.1　材料與儀器

　　山西明綠豆　大慶薩爾圖區(qū)博微物資經(jīng)銷處; AB-8 大孔吸附樹脂　購于天津南開大學(xué)樹脂有限公司;蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-iphenyl2- picrylhydrazyl, DPPH)、2，2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2，2′-azinobis-3-ethylbenzothiazoline -6- sulphonic acid, ABTS)　上海 Macklin 公司;6-羥基2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox) 　 Sigma 公司;乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)、三氯化鐵、水楊酸、亞硝酸鈉、氧氧化鈉、無水乙醇、硝酸鋁等試劑　安達(dá)市清順化學(xué)試劑公司;總抗氧化能力(total antioxidative capability,T-COA)試劑盒　購于南京建成生物工程研究所。

　　AL-204 電子天平　北京瑞澤康科技有限公司;粉碎機(jī)　天津市泰斯特儀器有限公司;連續(xù)化制備型不銹鋼分離柱　實(shí)驗(yàn)室自制;UPLC-Triple-TOF/MS 系統(tǒng) ：AcquityTM ultra 型高效液相色譜儀　美國 Waters 公司;TU1810 型紫外分光光度計(jì)　北京普析通用儀器有限公司;CW-200 型超聲-微波協(xié)同萃取儀　上海新拓分析儀器科技有限公司。

　　1.2　實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 綠豆皮黃酮粗提液的制備

　　采用康維良等[10] 的方法稍作改動(dòng)，將綠豆皮在 40 ℃ 下恒溫干燥，粉碎，過 80 目篩后密封保存。配制料液比為 1:31(g/mL)綠豆皮粉末樣品溶液，采用超聲-微波協(xié)同萃取儀進(jìn)行綠豆皮黃酮的提取，微波功率為 521 W，時(shí)間 30 min，結(jié)束后將提取物進(jìn)行 3500 r/min 離心 10 min，收集上清液，低溫保存?zhèn)溆茫玫骄G豆皮黃酮粗提液(測得綠豆皮提取物中黃酮含量為 2.26%)。

　　1.2.2 綠豆皮黃酮的分離純化　采用本實(shí)驗(yàn)室自制的連續(xù)化制備型不銹鋼分離裝置，根據(jù)課題組前期分離純化條件對綠豆皮黃酮粗提物進(jìn)行分離純化。以 1 mL/min 流速將綠豆皮黃酮粗提物泵入分離柱中進(jìn)行飽和吸附，然后分別采用 1~1.5 倍體積的 20%、 40%、60%、80% 乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集不同洗脫級分的洗脫液備用。

　　1.2.3 綠豆皮黃酮抗氧化能力的測定

　　1.2.3.1 DPPH 自由基清除能力的測定　參照陳青青等[11] 方法稍作改動(dòng)，分別取樣品 0.1 mL 樣品(濃度 2%)，加入 3.9 mL DPPH(30 μmol/L)溶液，避光 30 min，517 nm 測吸光度，按式(1)計(jì)算 DPPH 自由基清除率。 DPPH自由基清除率(%) = ( 1− A1 −A3 A2 ) ×100 式(1)式中：A1 為靜置 30 min 后樣品的吸光度;A2 為等體積的乙醇對照的吸光度 ;A3 為待測樣品與 DPPH 等體積乙醇吸光度。

　　1.2.3.2 ABTS 自由基清除能力　參照陳青青等[11] 方法，分別取樣品 0.1 mL 樣品(濃度 2%)，加入 5 mL ABTS+ ·工作液靜置 10 min，734 nm 測吸光度，以 0.1 mL 乙醇作為對照。ABTS 自由基清除率按式(2)計(jì)算; ABTS自由基清除率(%) = AS −Am AS ×100 式(2)式中：AS 為乙醇對照組吸光度;Am 為樣品吸光度。

　　1.2.3.3 羥自由基清除能力　參照封燕等[12] 的方法稍作改動(dòng)，分別取樣品 0.1 mL 樣品(濃度 2%)，依次加入 1 mL 6 mmol/L FeSO4 溶液、1 mL 6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和 1 mL 6 mmol/L H2O2 溶液，于 37 ℃ 水浴 30 min，510 nm 測吸光度，以 0.1 mL 蒸餾水代替樣品作為對照組。羥自由基清除率按式(3)計(jì)算;羥自由基清除率(%) = ( 1− Ai −Aj A0 ) ×100 式(3)式中：Ai 為待測樣品吸光度;Aj 為對照組吸光度;A0 為雙蒸水代替 H2O2 溶液作為底物對照的吸光度。

　　1.2.3.4 T-AOC 的測定　采用 T-AOC 檢測試劑盒進(jìn)行分析。 1.2.4 綠豆皮黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)分析　稱取 10 mg 凍干后的樣品粉末，加甲醇 10 mL 溶解，10000 r/min 離心 15 min，取上清液用于測試。使用 0.1% 甲酸乙腈為流動(dòng)相，流速為 0.5 mL/min，檢測波長 280 nm。采用 waters T3 色譜柱(50 mm×3.0 mm i.d. ,1.8 μm)，進(jìn)樣量 5 μL，柱溫箱 40 ℃。采用 UPLC-Triple-TOF/ MS 系 統(tǒng) 進(jìn) 行 黃 酮 結(jié) 構(gòu) 測 定 ， 并 根 據(jù) Scifinder 和 Reaxy 數(shù)據(jù)庫檢索和推測黃酮類化合物組分。

　　1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

　　所得數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的平均值，用 Statistix 8(分析軟件, St Paul, MN) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，平均數(shù)之間顯著性差異(P<0.05)通過 Turkey HSD 進(jìn)行多重比較分析。并采用 SigmaPlot 12.5 作圖。

　　2　結(jié)果與分析

　　2.1　綠豆皮黃酮類化合物的分離

　　圖 1 反映的是綠豆皮黃酮梯度洗脫樣品圖。由圖可知，綠豆皮黃酮飽和吸附后，采用不同洗脫溶劑等體積洗脫制備得到的綠豆皮黃酮級分濃度不同，隨著洗脫劑乙醇濃度的增強(qiáng)，洗脫樣品的顏色也逐漸變深，其中 60% 洗脫樣品顏色最深，表明 60% 洗脫樣品中得到的溶質(zhì)相對較多，80% 醇洗液在連續(xù)分離中既可將分離柱中的剩余組分洗脫下來，還可起到清洗分離柱的效果，以保證分離柱的下一輪吸附洗脫。圖 2 反映的是綠豆皮黃酮梯度洗脫四個(gè)級分的得率。由圖可知，四種洗脫溶劑得到的黃酮類化合物濃度分別為 0.0056、0.021、0.0257、0.0044 mg/mL，與圖 1 結(jié)果結(jié)合分析得出，綠豆皮黃酮類化合物集中在 40% 和 60% 洗脫樣品中，達(dá)到綠豆皮黃酮粗提物的 80% 以上;其中 60% 洗脫樣品濃度最高;20% 醇洗液由于極性相對較低，洗脫液中含量較低;由于綠豆皮黃酮類化合物集中在 40% 和 60% 洗脫樣品中，因而 80% 醇洗液中樣品也較低。結(jié)合圖 1 和圖 2 也可以看出綠豆皮黃酮類化合物組分集中在 40%~ 60% 醇洗液中。

　　2.2　不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力

　　圖 3 反映的是梯度洗脫后不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力。由圖可知，等濃度的各個(gè)洗脫級分的 DPPH·、ABTS+·、·OH 清除能力和總抗氧化能力不同，20%、80% 洗脫級分的抗氧化能力最低，60% 洗脫級分的抗氧化能力顯著強(qiáng)于其他洗脫級分(P<0.05)，與未分級樣品相比，60% 洗脫級分的 ABTS+·、·OH 清除能力和總抗氧化能力顯著高于等濃度的黃酮粗提物(P<0.05)，但 DPPH·清除能力顯著低于黃酮粗提物(P<0.05)，這說明洗脫樣品中的組分與未分級綠豆皮黃酮粗提物存在不同，不同的抗氧化組分其作用效果及機(jī)理不同，這與自由基種類也存在一定的相關(guān)性，ABTS+ ·和·OH 屬于帶電荷的自由基，而 DPPH· 卻并不帶電荷，所以抗氧化效果不同;40% 洗脫級分盡管抗氧化能力強(qiáng)于 20% 和 80% 洗脫樣品，但顯著低于 60% 洗脫級分(P<0.05)，這也表明不同洗脫樣品中的組分不同，因此抗氧化能力不同，也表明綠豆皮黃酮中主要抗氧化組分集中在 60%洗脫液中。

　　2.3 60% 醇洗脫綠豆皮黃酮類化合物結(jié)構(gòu)分析

　　圖 4 反映的是 60% 醇洗樣品的液相色譜圖，由圖可知，純化后綠豆皮黃酮樣品中的吸收峰主要有 3 個(gè)，分別出現(xiàn)在 4.59、6.06 和 6.20 min，說明 60% 醇洗脫液中綠豆皮黃酮類化合物主要含有 3 種物質(zhì)。 2.3.1 成分Ⅰ分析 圖 5 是成分 I 的一級二級質(zhì)譜圖和可能的結(jié)構(gòu)式。該化合物的出峰時(shí)間為 4.59 min， [M-H]−為 449.1107，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C21H22O11，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-90-H]、[M-120-H] 等碎片離子，該化合物為碳苷，且含有六元糖，根據(jù) cifinder 和 reaxy 數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(eriodictyol-6-C-β-D-glucopyranoside)。

　　2.3.2 成分Ⅱ分析 圖 6 是成分 II 的一級二級質(zhì)譜圖和可能的結(jié)構(gòu)式。該化合物的出峰時(shí)間為 6.06 min， [M-H]−為 431.0992，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C21H20O10，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-90-H]、[M-120-H]等碎片離子，該化合物的為碳苷，且含有六元糖，根據(jù) Scifinder 和 Reaxy 數(shù)據(jù)庫檢索，根據(jù)保留時(shí)間分析，推測該化合物為牡荊素(vitexin)。

　　2.3.3 成分Ⅲ分析 圖 7 是成分 III 的一級二級質(zhì)譜圖和可能的結(jié)構(gòu)式。該化合物的出峰時(shí)間為 6.20 min，[M-H]−為 431.1007，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為 C21H20O10，根據(jù)二級質(zhì)譜 [M-90-H]、 [M-120-H] 等碎片離子，該化合物的為碳苷，且含有六元糖，根據(jù) Scifinder 和 Reaxy 數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為異牡荊素(isovitexin)。

　　3　討論與結(jié)論

　　本研究結(jié)果表明，綠豆皮較強(qiáng)的抗氧化活性與其富含黃酮類化合物有關(guān)。羅磊等和 Kanatt 等[9,13] 的研究表明，綠豆皮比仁核具有較強(qiáng)的抗氧化性，這是由于皮殼中含有較高的黃酮類化合物。Li 等[14] 的研究發(fā)現(xiàn)蕎麥皮殼中含有較高的黃酮類化合物，其主要黃酮類物質(zhì)是牡荊素和異牡荊素，這兩種組分被認(rèn)為是最主要的抗氧化劑。有研究表明綠豆具有清熱解毒作用是由于其活性部位提高了機(jī)體對氧自由基的清除能力，減輕了過量的氧自由基引起的機(jī)體損傷[15−17]。本研究通過連續(xù)制備色譜分離純化得出的抗氧化活性組分經(jīng)鑒定推測出其主要含有牡荊素、異牡荊素和圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷。牡荊素和異牡荊素具有較高的抗氧化能力已被很多研究所證實(shí)，牡荊素能保護(hù) DNA 氧化損傷，使細(xì)胞免受·OH 誘導(dǎo)的氧化損傷，降低 CSHFD 小鼠肝臟脂肪沉積，減輕脂質(zhì)代謝，抑制肝臟炎癥反應(yīng)。此外，牡荊素可顯著降低肝巨噬細(xì)胞浸潤，明顯下調(diào)肝 SREBP-1c、 FAS、ACC mRNA 和蛋白表達(dá)[18−19]。異牡荊素可通過抑制機(jī)體的氧化反應(yīng)改善順鉑誘導(dǎo)的腎損傷[20]。黃酮類化合物的 B 環(huán)是其清除自由基的主要活性部位，當(dāng)該環(huán)存在鄰酚羥基結(jié)構(gòu)時(shí)，抗氧化活性增強(qiáng)。潘國慶等[21] 的研究表明，B 環(huán)上有鄰位羥基，自由基清除能力會(huì)顯著增強(qiáng)，如槲皮素比山萘素的 B 環(huán)上多了一個(gè)鄰位羥基，其活力顯著增強(qiáng)。胡棟寶等[22] 的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物的 B 環(huán)上含有鄰位羥基容易形成分子內(nèi)氫鍵，這有利于分散苯氧自由基上的單電子，此種結(jié)構(gòu)具有較高的抗氧化活性[23]。本研究推測的另外一種成分圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷的 B 環(huán)上有一個(gè)鄰位羥基，由此，除了牡荊素和異牡荊素這兩種抗氧化組分外，這可能是 60% 洗脫樣品中綠豆皮黃酮具有較強(qiáng)抗氧化能力的另外一個(gè)原因。本文對綠豆加工副產(chǎn)物中綠豆皮的黃酮類化合物進(jìn)行了提取及分離純化，鑒定出綠豆皮黃酮中具有較強(qiáng)抗氧化能力的 3 個(gè)組分結(jié)構(gòu)，這為綠豆加工副產(chǎn)物資源的利用提供了理論依據(jù)。