miRNA-375通過MYC/EMT對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲和遷移影響

　　[摘要] 目的 探究miRNA-375(miR-375)通過MYC/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)侵襲和遷移的影響。

　　方法 將未做任何處理的NSCLC細(xì)胞A549作為空白組，轉(zhuǎn)染空載慢病毒的A549細(xì)胞作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-375慢病毒的A549細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)miR-375在NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá)量，以及miR-375在正常肺組織細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)和A549細(xì)胞中的表達(dá)量;通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組細(xì)胞的侵襲、遷移能力;采用Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞中MYC蛋白和EMT相關(guān)蛋白(E-鈣黏蛋白、波形蛋白)的表達(dá)量。

　　結(jié)果 miR-375在NSCLC組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(t=16.88，P<0.05)，在A549細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于BEAS-2B細(xì)胞(t=8.51，P<0.05)。過表達(dá)miR-375后，實(shí)驗(yàn)組與空白組和對(duì)照組相比，NSCLC細(xì)胞的侵襲(F=29.55，P<0.05)、遷移(F=90.21，P<0.05)能力增強(qiáng)，MYC蛋白表達(dá)增加(F=37.15，P<0.05)，E-鈣黏蛋白表達(dá)減少(F=47.25，P<0.05)，波形蛋白表達(dá)增加(F=77.64，P<0.05)。

　　結(jié)論 上調(diào)miR-375可以通過MYC/EMT影響NSCLC的侵襲和遷移能力。

　　[關(guān)鍵詞] 微RNAs;癌，非小細(xì)胞肺;基因，myc;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

　　《東方食療與保健》OrientalDiet-TherapyandHealthCare(月刊)是我國(guó)目前唯一的一份以介紹藥膳食療內(nèi)容為主的科普性期刊，它填補(bǔ)了我國(guó)藥膳食療刊物的空白。

　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是全球惡性腫瘤死亡的主要原因[1-2]，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%以上[3]。NSCLC目前的主要治療方法是手術(shù)、放療和化療，盡管放療和化療的應(yīng)用使NSCLC預(yù)后得到很大改善，但其生存率還是很低[4]，所以NSCLC的靶向研究顯得尤為重要。近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)肺癌的進(jìn)展、診斷以及治療起著關(guān)鍵作用，其在肺癌的治療研究中備受關(guān)注[5]。miRNA是一類長(zhǎng)約20個(gè)氨基酸的小RNA，它可以與特定的靶點(diǎn)結(jié)合，影響靶位點(diǎn)的mRNA翻譯，進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的表達(dá)[6]。有研究表明，miRNA-375(miR-375)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡有著密切的聯(lián)系，而且miR-375的表達(dá)與癌癥病人的總生存率相關(guān)，所以推測(cè)miR-375可能是一種有用的臨床預(yù)后生物標(biāo)志物[7-8]。JUNG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MYC可以受miR-375的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展和表型。MYC家族包括C-MYC、N-MYC和L-MYC，對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移都有很重要的作用[10-11]。已有研究表明，一些藥物可以通過抑制MYC通路的激活來抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[12];hsa-miR-24則可以通過調(diào)節(jié)c-MYC/EMT軸來抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[13];MYC還可以通過抑制RPS19/EMT信號(hào)傳導(dǎo)的激活來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。本研究旨在探討miR-375是否可通過MYC/EMT對(duì)NSCLC的侵襲和遷移產(chǎn)生影響。

　　1 材料與方法

　　1.1 細(xì)胞與樣本

　　所用NSCLC細(xì)胞(A549)和正常肺組織細(xì)胞(BEAS-2B)由青島大學(xué)博雅樓實(shí)驗(yàn)室凍存。A549細(xì)胞用RPMI-1640(HyClone，美國(guó))培養(yǎng)液培養(yǎng)，BEAS-2B細(xì)胞用LHC-9(HyClone，美國(guó))培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)兩種培養(yǎng)液都加入體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(索萊寶，北京)。含EDTA的胰蛋白酶(索萊寶，北京)用于消化貼壁細(xì)胞。NSCLC組織和癌旁組織的新鮮樣本各30例，來自青島市市立醫(yī)院。本研究的組織來源病人均簽署了書面同意書，研究獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

　　1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　將A549細(xì)胞接種于96孔板中，每孔10 000個(gè)，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)共分3組，在96孔板中未做任何處理的A549細(xì)胞作為空白組，將轉(zhuǎn)染含空載體慢病毒(吉?jiǎng)P基因公司，上海)的A549細(xì)胞作為對(duì)照組，將轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-375慢病毒(吉?jiǎng)P基因公司，上海)的A549細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。將3組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10 h后，移除96孔板中的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，每孔100 μL。然后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞中miR-375的表達(dá)量。

　　1.3 qRT-PCR

　　收集長(zhǎng)勢(shì)良好的細(xì)胞，按照iso plus RNA提取試劑盒(Takara，日本)的說明書提取3組細(xì)胞的總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq RR420A(Takara，日本)進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)細(xì)胞中miR-375的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán);60 ℃、15 s。實(shí)驗(yàn)所用引物均購(gòu)自上海生工，其中U6作為miRNA-375的內(nèi)源性參照。引物序列見表1。

　　1.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)

　　①遷移實(shí)驗(yàn)：向24孔板(康寧，美國(guó))的3個(gè)孔中加入含體積分?jǐn)?shù)0.15胎牛血清的培養(yǎng)液，每孔500 μL，將3個(gè)Transwell小室(康寧，美國(guó))分別放入3個(gè)孔中。取3組細(xì)胞各5×104個(gè)分別接種于以上3個(gè)Transwell小室內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用棉簽擦拭3個(gè)Transwell小室的內(nèi)膜，之后小室用甲醇溶液固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS洗3次，拍照，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。②侵襲實(shí)驗(yàn)：將基質(zhì)膠(康寧，美國(guó))與完全培養(yǎng)液按1∶9的比例稀釋，將稀釋后的混合液按每孔100 μL加入Transwell小室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中4 h，其余實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

　　1.5 Western blot檢測(cè)

　　取3組細(xì)胞，用PBS洗2次后加入1 mL的PBS，使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下分別放入3個(gè)離心管中，以5 000 r/min離心5 min。去上清留細(xì)胞沉淀，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min，上清即為總蛋白。將提取的蛋白質(zhì)加入上樣緩沖液SDS-Loading Buffer，沸水浴煮5 min。取45 μg蛋白置SDS-PAGE凝膠中電泳，電泳結(jié)束后將膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，美國(guó))。用脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下與MYC(1∶1 000，CST)、β-actin(1∶3 000，Bioss)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin，1∶1 000，CST)、波形蛋白(Vimentin，1∶1 000，CST)的一抗一起孵育過夜;加入二抗(1∶1 000，Abcam)低速振蕩60 min。用超敏型化學(xué)發(fā)光底物試劑(ECL)進(jìn)行蛋白條帶成像，分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。