夾板外固定與散巴布劑對橈骨骨折模型兔骨愈合的影響

　　摘要背景：目前臨床治療長骨骨折的主要手段是石膏或夾板外固定及接骨板或者髓內(nèi)釘?shù)葍?nèi)固定，同時也可服用加速骨折愈合的藥物或者在患處外敷藥物。目的：探討夾板外固定聯(lián)合散巴布劑對于橈骨骨干骨折的恢復(fù)是否有改善作用。方法：取18只新西蘭大白兔，制作左側(cè)橈骨完全性骨折模型，分成3組，未干預(yù)組不進行任何干預(yù)，夾板固定組用夾板外固定處理，散巴布劑組使用夾板外固定處理并輔助散巴布劑藥物外敷(每天換藥一次)，每組6只。術(shù)后2，4，6周，取骨痂位置制備樣品，應(yīng)用原子力顯微鏡檢測骨痂粗糙度和顆粒度。結(jié)果與結(jié)論：①夾板固定組、散巴布劑組可以明顯觀察到骨痂的粗糙表面和明顯的顆粒結(jié)構(gòu)，這些礦物顆粒附著在膠原纖維上，呈現(xiàn)出魚鱗狀，其中散巴布劑組的膠原結(jié)構(gòu)遠遠小于夾板固定組;②隨著愈合時間的增長，骨痂礦物顆粒尺寸逐漸減小，散巴布劑組同期骨礦化顆粒尺寸較夾板固定組小47.5%-69.6%;同時隨著愈合時間的推移骨痂粗糙度逐漸降低，散巴布劑組術(shù)后2周的骨痂粗糙度較夾板固定組小約 69%，術(shù)后6周兩組骨痂粗糙度趨于近似;③結(jié)果表明散巴布劑對骨折愈合具有促進作用。

　　關(guān)鍵詞：散巴布劑;夾板;骨折愈合;原子力顯微鏡;粗糙度;顆粒度

　　李睿; 史文; 楊士彩; 呂林蔚; 張春秋， 中國組織工程研究 發(fā)表時間：2021-11-25

　　0 引言 Introduction

　　長骨骨干骨折是常見于外界暴力沖擊造成的創(chuàng)傷性骨折 [1]，目前臨床上的主要治療手段是石膏固定或夾板固定等外固定，以及接骨板或者髓內(nèi)釘?shù)葍?nèi)固定 [2-5]。使用外固定治療手段一般還會同時服用加速骨折愈合的藥物或者在患處外敷藥物。詳細分析藥物對骨折愈合的影響作用，對臨床選擇合適的治療方案具有重大意義。夾板外固定聯(lián)合散巴布劑外敷是當(dāng)前中醫(yī)治療長骨骨折主要的治療手段。夾板固定減輕了患者植入內(nèi)固定假體的術(shù)中風(fēng)險與術(shù)后痛苦，同時散巴布劑外敷又能夠有效促進骨折區(qū)域的成骨作用，加速骨折愈合。散巴布劑的主要成分為三七總皂苷與血竭素，其中血竭素有化瘀止血的功效，主要用于骨折位置皮膚的消腫 [6-8];三七總皂苷能夠促進成骨細胞的增殖和分化 [9-12]，對骨髓間充質(zhì)干細胞的凋亡有抑制作用，對血管新生也有促進作用 [13-14]。

　　表征骨折愈合的手段有透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡等方法，這些方法可以對膠原蛋白和礦物質(zhì)成分的骨基質(zhì)進行高分辨率成像 [15]，然而這兩種技術(shù)都有很大的局限性，對樣品的制備比較苛刻。原子力顯微鏡也是一種高分辨率成像方式，相較透射電子顯微鏡或掃描電子顯微鏡的破壞性更小。使用原子力顯微鏡成像觀察的樣品可以保持完整，并且可以在空氣或液體中、室溫或培養(yǎng)條件下成像，這意味著測量的特性是樣品的特征，加工或成像的偽影可能性較小。原子力顯微鏡可以清晰地描述納米尺度下骨痂的表面形貌，主要表征形式為骨組織表面的粗糙度和顆粒度，用精確定量方法來評估骨的納米級特性。目前針對散巴布劑促進骨折愈合在納米尺度的表現(xiàn)形式仍然鮮有報道。在納米級表征骨痂有助于人們進一步理解散巴布劑在促進骨折愈合方面的功效。實驗擬采用新西蘭大白兔進行骨折愈合康復(fù)模擬，通過對比分析夾板外固定愈合與夾板外固定愈合輔助散巴布劑外敷治療方案中骨痂納米的形態(tài)，得出散巴布劑對骨折愈合的促進作用。

　　1 材料和方法 Materials and methods

　　1.1 實驗設(shè)計 夾板外固定與散巴布劑促進骨折愈合的動物實驗。

　　1.2 時間及地點 動物手術(shù)與飼養(yǎng)實驗于 2020 年 3-12 月在天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所完成。骨組織的原子力顯微鏡掃描實驗于 2021 年 1-3 月在天津理工大學(xué)完成。 1.3 材料 散巴布劑 ( 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，具體成分保密 )。

　　實驗動物：選取 18 只 6 月齡雌性健康新西蘭大白兔 [ 實驗動物許可證編號：SCXK(Beijing) 2016-0007]，平均體質(zhì)量 2.5 kg。實驗前將所有動物適應(yīng)性分籠喂養(yǎng) 2 周。動物實驗嚴(yán)格按照天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物委員會的實驗要求執(zhí)行，批文編號：IMPS-EAEP-Z-2019108-01。

　　1.4 方法 取 18 只新西蘭大白兔，臀部肌注速眠新Ⅱ號 ( 鹽酸賽拉嗪注射液 )0.15 mL/kg 進行麻醉。雙上肢脫毛置于手術(shù)臺，術(shù)區(qū)常規(guī)碘伏消毒。取左側(cè)橈骨中 1/3 前外側(cè)縱行切口，切口長約 18 mm，切開皮膚及皮下組織暴露橈骨中 1/3 之處。用口腔磨鉆橫斷造成 3 mm 的橈骨完全性骨折，骨折斷端不做特殊固定。用生理鹽水反復(fù)沖洗切口，并逐層縫合，分 3 組處理，每組 6 只：未干預(yù)組僅做術(shù)后縫合創(chuàng)口并消毒包扎，自然狀態(tài)生長;夾板固定組術(shù)后縫合創(chuàng)口并消毒包扎，使用夾板綁縛處理;散巴布劑組術(shù)后縫合創(chuàng)口并消毒，將散巴布劑均勻涂抹于紗布上，平均厚度為 1 mm 左右，隨后將紗布包扎在骨折區(qū)域，最后用夾板進行綁縛處理，每天換藥一次。將兔放入飼養(yǎng)籠內(nèi)蘇醒。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，給予正常飼料喂養(yǎng)及飲水，術(shù)后 3 d 內(nèi)注射硫酸慶大霉素預(yù)防切口感染， 4×104 U/ 次，1 次 /d，觀察動物切口愈合情況。手術(shù)過程如圖 1 所示。

　　1.5 主要觀察指標(biāo) 術(shù)后 2，4，6 周時，每組隨機選取 2 只兔進行安樂死處理，取左側(cè)橈骨組織。首先利用硬組織切割機在骨痂成型位置沿著骨折線方向?qū)锕乔懈顬?2 段，各自形成一個骨折截面。然后分別將 2 段橈骨以垂直骨折截面方向 2 mm 左右位置再次切割，形成厚度約 2 mm 的切片，冷凍保存。切割過程中始終保持循環(huán)冷卻水輔助降溫。配置環(huán)氧樹脂包埋液混合攪拌至均勻無絲絮狀。將切片放置在包埋盒內(nèi)，倒入包埋液用攪拌棒引流至剛好覆蓋切片表面。放置 24 h 后，包埋切片固化完成。利用自行設(shè)計的專用夾具對包埋切片進行固定。然后在金相磨拋機上安裝 400 目砂紙對包埋切片中含有骨折截面的一側(cè)進行粗磨，至剛好暴露出骨折截面;更換 800 目砂紙細磨，降低表面粗糙度以滿足原子力顯微鏡檢測要求。

　　通過使用原子力顯微鏡探針 (Bruker 公司的 RTESPA-300) 在標(biāo)準(zhǔn)原子力顯微鏡模式下采集圖像，該探針具有 125 µm 的懸臂長度、40 µm 的懸臂寬度、3.4 µm 的懸臂厚度、 40 N/m 的 力 常 數(shù)、300 kHz 的 諧 振 頻 率。 掃 描 模 式 為 PeakForce QNM in Air，掃描速率為 0.4 Hz，峰值力振幅為 150 nm，縱橫比為 1.0。掃描完成后進行壓平處理，對樣品中出現(xiàn)的明顯的曲面或斜面進行壓平，即對圖像進行一階平坦化處理，再使用 NanoScope Analysis 軟件測量粗糙度與顆粒度。平均粗糙度定義為給定區(qū)域內(nèi) z 值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用以下公式計算：通過原子力顯微鏡后處理軟件 NanoScope Analysis 分析圖像，選擇感興趣區(qū)得到粗糙度和顆粒度，見表 1 所示。圖注：兩組均可觀察到骨痂的粗糙表面和明顯的顆粒結(jié)構(gòu)，這些礦物顆粒附著在膠原纖維上，呈現(xiàn)出魚鱗狀，由黑色橢圓標(biāo)記;其中固定夾板組在骨痂表面發(fā)現(xiàn)大量的膠原纖維結(jié)構(gòu)，散巴布劑組的膠原結(jié)構(gòu)遠遠小于夾板固定組圖 3 |夾板固定組與散巴布劑組術(shù)后不同時間點的骨折面峰值力誤差圖 Figure 3 | Peak force errors of fracture surface in the splintage group and splintage adjuvant Shenxiaosan group at various time points after surgery Rq N ∑(zi -zavg) 2 式中，zavg 為給定區(qū)域內(nèi) z 值的平均值，zi 為當(dāng)前 z 值， N 為給定區(qū)域內(nèi)的點數(shù)。

　　2 結(jié)果 Results

　　通過原子力顯微鏡掃描觀察各組愈傷組織的表面形貌，夾板固定組與散巴布劑組術(shù)后 2，4，6 周的三維高度圖見圖 2 所示。

　　夾板固定組與散巴布劑組術(shù)后 2，4，6 周的峰值力誤差圖見圖 3 所示。從圖像中可以明顯觀察到骨痂的粗糙表面和明顯的顆粒結(jié)構(gòu)，這些礦物顆粒附著在膠原纖維上，呈現(xiàn)出魚鱗狀，由黑色橢圓標(biāo)記;其中固定夾板組在骨痂表面發(fā)現(xiàn)大量的膠原纖維結(jié)構(gòu)，散巴布劑組的膠原結(jié)構(gòu)遠遠小于夾板固定組。

　　3 討論 Discussion

　　目前臨床上促進骨折愈合的手段比較多，常見的手段有體外高頻低載機械振動加載 [16]、雙膦酸鹽類口服藥物 [17-18]、中藥巴布劑外敷等 [19-21]。實驗采用固定夾板體外固定，同時在骨折區(qū)域敷用散巴布劑促進骨折愈合，這是目前中醫(yī)領(lǐng)域常見的骨折治療方案，實驗結(jié)果顯示散巴布劑能夠顯著促進骨折面的成骨作用，縮短骨折愈合時間。

　　散巴布劑組術(shù)后 2，4，6 周骨痂區(qū)域的骨礦物顆粒直徑中位數(shù)分別為 160.7，101.6，52.0 nm，夾板固定組術(shù)后 2，4，6 周骨痂區(qū)域的骨礦物顆粒中位數(shù)分別為 306.3， 209.6，171.4 nm，較散巴布劑組分別高出 90.6%，201.5%， 229.6%。散巴布劑組骨痂區(qū)域礦物顆粒尺寸明顯小于未干預(yù)組，并且散巴布劑組術(shù)后 2 周的骨礦物顆粒尺寸與夾板固定組術(shù)后 6 周的骨礦物顆粒尺寸非常近似。MILOVANVIC 等 [22]的研究結(jié)果顯示，骨的納米力學(xué)性能顯著依賴于礦物晶體尺寸，其中礦物顆粒尺寸與骨組織的力學(xué)性能顯著負相關(guān)。此外，WALLACE[23] 對合成羥基磷灰石顆粒的研究中也發(fā)現(xiàn)較大的晶粒尺寸會降低材料強度。由此可以推斷出，從術(shù)后的第 2 周開始，散巴布劑組的骨痂強度就與未干預(yù)組和夾板固定組愈合時接近了。術(shù)后第 6 周時散巴布劑組的骨組織礦物顆粒尺寸已經(jīng)接近于正常健康骨組織 [24]，這說明應(yīng)用散巴布劑后骨折面的新生骨組織強度遠高于其他組，并且接近于健康狀態(tài)。從術(shù)后取骨大體觀測來看，所有分組的骨折面均愈合良好，但是從原子力顯微鏡影像數(shù)據(jù)觀測來看，只有應(yīng)用散巴布劑之后骨折面新生骨組織的力學(xué)性能才與健康狀態(tài)相近。術(shù)后第 6 周時未干預(yù)組和夾板固定組的礦物顆粒直徑仍然超高，說明骨折愈合后新生成的骨組織力學(xué)性能較差，在術(shù)后康復(fù)短期內(nèi)比散巴布劑組更容易出現(xiàn)二次骨折風(fēng)險。

　　骨痂的粗糙度是判斷骨折區(qū)域骨重建速率的一個重要指標(biāo)。MILOVANOVIC 等 [22] 的研究結(jié)果顯示，骨組織粗糙度越高骨重建進程越活躍。BARKARMO 等 [24] 的實驗結(jié)果顯示，健康大白兔的皮質(zhì)骨粗糙度均值為 71.7 nm，代表了平穩(wěn)的骨重建狀態(tài)。此次實驗中 3 組在術(shù)后 6 周時的骨痂粗糙度趨于相同水平，均值為 87 nm，略高于健康狀態(tài)，表明骨折區(qū)域已經(jīng)基本愈合完成;但在 2 周時散巴布劑組的骨痂粗糙度明顯小于夾板固定組及未干預(yù)組，可以看出散巴布劑在骨折后的 2 周內(nèi)就已經(jīng)加快了該區(qū)域的骨重建進程，縮短了骨折愈合時間。在第 2 周結(jié)束時骨重建進程已經(jīng)趨于穩(wěn)定，并且在隨后的第 4 周和第 6 周粗糙度沒有明顯變化，在散巴布劑的作用下骨愈合已經(jīng)提前完成并維持著穩(wěn)定正常的骨重建狀態(tài);而未干預(yù)組和夾板固定組的骨痂粗糙度明顯高于散巴布劑組，表明在未干預(yù)狀態(tài)下術(shù)后 6 周骨折面仍然沒有完全愈合，需要繼續(xù)保持治療狀態(tài)。

　　GAO 等 [16] 進行了間歇性高頻低載振動促進骨折愈合的實驗，結(jié)果顯示每天 3 次低頻振動對骨折愈合效果最明顯，其粗糙度中位數(shù)為 79.8 nm。此次實驗中散巴布劑組工況骨痂的粗糙度為 62.4 nm，對比可以看出散巴布劑的愈合效果與高頻低載振動相似。從愈合的時間進程來看，應(yīng)用散巴布劑后骨折愈合的時間明顯縮短。GAO 等實驗愈合開始的時間為 2 周，和此次實驗所觀察到的愈合時間基本一致，因此可以判斷出輔助手段對愈合的起始時間沒有太多影響，骨折患者不可以提早下床，輔助手段只是對骨痂愈合質(zhì)量起到較好的促進作用。在圖 3 的峰值力誤差圖中，每個像素位置的瞬時誤差信號通常比高度圖表現(xiàn)出更精細的表面特征，從圖中可以發(fā)現(xiàn)固定寬度的規(guī)則痕跡，即是膠原纖維結(jié)構(gòu)。膠原纖維的一個特征是纖維的 D-banding，膠原的 D-banding 產(chǎn)生振蕩表面形貌，其特征軸向重復(fù)距離為 67 nm[16]。在圖 3 中可以清晰看到 67 nm 帶狀圖案，這是典型的膠原纖維特征。骨組織的再生是隨著有序膠原纖維形成而發(fā)生的。夾板固定組相較散巴 布劑組有更多的膠原纖維裸露，沒有被礦化顆粒所填充，由此也可推斷出散巴布劑加速了膠原纖維礦化，表現(xiàn)出加速骨折愈合速率的現(xiàn)象;未干預(yù)組與夾板固定組在 6 周仍然處于愈合狀態(tài)。

　　實驗分析了散巴布劑促進骨折愈合的作用機制，但是在實驗過程中仍然存在一定的局限性：①首先，散巴布劑對骨折的愈合作用僅局限在定性研究，骨折區(qū)域的用藥劑量沒有嚴(yán)格確定。實驗過程中散巴布劑均勻敷在骨折患處，敷藥厚度為 1 mm 左右，以全部覆蓋骨折患處且無溢出為標(biāo)準(zhǔn)。另外，散巴布劑中主要有效成分三七總皂苷的含量也沒有進行嚴(yán)格測定，因此無法定量分析三七總皂苷對骨折愈合的促進作用。②其次，將骨痂制樣后進行原子力顯微鏡掃描的過程中僅選取骨痂形態(tài)最為突出的區(qū)域進行掃描，其采樣點并沒有覆蓋全部骨痂截面，因此基于掃描樣本量的分析結(jié)果可能會存在一定誤差。現(xiàn)存的局限問題將在今后的實驗中進行彌補。

　　根據(jù)以上散巴布劑促進橈骨骨折愈合的實驗結(jié)果，以及相關(guān)文獻的對比分析可以得出以下結(jié)論：①雖然手術(shù)內(nèi)固定治療高齡骨質(zhì)疏松性骨折的臨床療效更優(yōu) [25]，但對于術(shù)中、術(shù)后并發(fā)癥風(fēng)險高的老年患者，需要采用夾板外固定的傳統(tǒng)方式進行治療，散巴布劑可以作為非手術(shù)治療的一種替代方案。②散巴布劑作為有效促進成骨作用的藥物，其對骨折面的愈合能夠起到良好的促進作用，主要表現(xiàn)為縮短骨折愈合時間、加速膠原纖維礦化，從而讓老年患者盡早下床活動，盡可能避免由于長期臥床導(dǎo)致的并發(fā)癥的發(fā)生。相比于體外高頻低載振動或者超聲波輻射等促進骨折愈合的治療方案，在骨折復(fù)位術(shù)后短期內(nèi)散巴布劑促進骨折愈合的方案更適合于老齡患者。③阿侖膦酸鈉片是臨床治療骨質(zhì)疏松的常用藥物，在一定程度上可增加骨折處骨痂，但其對于骨折愈合的作用未被證實 [17]。散巴布劑的主要成分三七皂苷可以通過促進前成骨細胞的成骨分化加快骨折愈合，作為一種在骨折治療中的新藥具有廣闊前景。