作者：曾哲靈 奚光興 葛曉環(huán) 單位：南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室 南昌大學環(huán)境與化學工程學院 南昌大學生命科學與食品工程學院

1材料與方法

1.1材料與儀器苦瓜藤購自農村；牛血清蛋白購自美國Sigma公司；葡萄糖、考馬斯亮藍G-250、磷酸、苯酚、濃硫酸、鹽酸溶液、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑皆為國產分析純。KQ5200E型超聲波清洗器（40KHZ，200W）昆山超聲儀器有限公司；HH恒溫水浴箱中大儀器廠；765pc型紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；R系列旋轉蒸發(fā)儀上海申生科技有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司

1.2實驗方法

1.2.1苦瓜藤多糖的提取工藝流程新鮮的苦瓜藤曬干后，剪成2~3cm的小段，粉碎機粉碎，60℃條件下烘干至無游離水，取一定量的苦瓜藤藤粉末，按一定條件超聲波提取后，離心取上清液，過濾，50℃真空旋轉濃縮提取液，加入4倍體積的無水乙醇，4℃下醇沉8~12h，醇沉兩次，離心，乙醚洗滌，烘干，得苦瓜藤粗多糖。

1.2.2葡萄糖標準曲線的制備[14-15]準確稱取105℃烘至恒重的葡萄糖標品1g，蒸餾水定容至1L，移取2mL，用25mL的容量瓶定容，得0.08mg/mL葡萄糖標液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖標液于25mL比色管中，補足蒸餾水至2.0mL，加1.0mL6%苯酚，再加入5.0mL濃硫酸，搖勻，靜置冷卻至室溫，在490nm處測定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。葡萄糖含量與吸光度值經回歸處理，回歸方程為：A=14.373C-0.0133，R2=0.9969(n=8),糖含量在8～64μg線性良好，見圖1。

1.2.3苦瓜藤多糖得率的測定[16]取提取液上清液，過濾，定容至250mL，分別吸取0.1mL提取液，補足水至2.0mL,測定吸光度值，根據測得的吸光度值A，參照葡萄糖標準曲線，計算出多糖濃度，進而得到得率。

1.2.4超聲波提取單因素實驗

1.2.4.1提取溫度準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比為1:40(g/mL)，pH為7，分別取30、40、50、60、70℃，超聲提取20min，離心取上清液，過濾，計算多糖得率，每個因素做四個平行。

1.2.4.2料液比準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度為60℃，pH為7，料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)，超聲20min，余下操作如1.2.4.1。

1.2.4.3提取時間準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度為60℃、料液比1:30(g/mL)，pH為7，分別超聲10、20、30、40、50min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.4.4pH準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度60℃、料液比1:30(g/mL)、超聲時間30min，研究不同pH條件3、5、7、9、11下的多糖提取得率，余下操作如1.2.4.1。

1.2.5苦瓜藤多糖超聲波提取的正交實驗設計[17]在單因素實驗的基礎上進行L9(34)正交實驗，因素水平表見表1。

1.2.6熱水提取法單因素實驗設計熱水提取法單因素實驗，并優(yōu)化工藝，比較分析兩種提取方法的優(yōu)劣。以料液比、提取時間、提取溫度這3個單因素為研究目標。

1.2.6.1料液比準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度70℃，料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)，熱水提取90min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.2時間準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度70℃、料液比1:50(g/mL)，分別浸提30、60、90、120、150min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.3溫度準確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比1:50(g/mL)、浸提時間90min，分別在50、60、70、80、90℃條件下提取，之后操作如1.2.4.1。

1.2.7苦瓜藤多糖熱水提取的正交實驗設計根據單因素實驗結果，設計L9(33)正交實驗，因素水平表見表2。

1.2.8超聲波提取法與熱水提取法的比較分別取5.0g苦瓜藤粉末2份，分別用超聲波與熱水提取的最佳工藝各提取2次，測定其多糖濃度，得出多糖得率，比較兩種方法的提取效率。

1.3統(tǒng)計分析各組實驗數據平行4次，結果以平均值±標準偏差的形式表示。數據采用GraphPadPrism（5.01版）進行分析，結果顯示單因素數據的p值<0.05，具有統(tǒng)計顯著性。采用正交助手Ⅱ（3.1版）對正交實驗結果進行直觀、極差和顯著性分析。

2結果與分析

2.1超聲波提取實驗結果

2.1.1單因素實驗結果

2.1.1.1提取溫度對苦瓜藤多糖得率的影響由圖2可見，苦瓜藤多糖得率隨著溫度的升高而上升，但到達60℃時趨于平緩，考慮到在高溫下部分多糖分子會發(fā)生鍵的斷裂，結構破壞，其活性會遭到破壞。同時過高的溫度對設備要求較高，耗能大，故溫度選在60℃為宜。

2.1.1.2料液比對苦瓜藤多糖得率的影響由圖3可知，苦瓜藤多糖的得率隨著料液比先增高后下降，在1:30(g/mL)達到最大。1:30(g/mL)以后提取率下降的原因，可能是料液比過大,會增加超聲波破碎細胞的阻力,使細胞破碎程度下降,降低多糖的提取率;如果料液比過小,又沒有足夠的水溶解出苦瓜藤多糖,也會使提取率降低[18]。故料液比宜取1:30(g/mL)。

2.1.1.3超聲時間對苦瓜藤多糖得率的影響由圖4可知，隨著時間的增長，提取率逐漸上升，到30min時達到最大，時間再增加時提取率又會下降，造成這一現象的原因可能是超聲波作用的時間過長,也會使得部分多糖的高分支結構受到破壞,使其溶于水的特性消失[18]，從而降低了多糖提取率。故時間宜取30min。2.1.1.4pH環(huán)境對苦瓜藤多糖得率的影響由圖5可見，多糖得率隨著pH增加而升高，可見多糖在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，結構易變化，或分解，造成提取率降低，而在堿性環(huán)境下比較穩(wěn)定，但是，過堿的環(huán)境對多糖的品質會有一定的影響，且多糖得率從pH為7時增幅就不大，故pH宜取7。

2.1.2超聲波提取正交實驗結果超聲波提取苦瓜藤多糖正交實驗結果見表3。由表3可知，四因素對苦瓜藤多糖得率的影響大小為：溫度>超聲時間>pH>料液比。其最佳提取工藝參數為A3B3C3D3，但由于pH和料液比為次要因素，為節(jié)約成本考慮，調整pH為7，料液比為1:30(g/mL)，其組合為A3B2C3D2。與A3B3C3D3做驗證性比較，結果表明，A3B2C3D2的得率為2.36%，A3B3C3D3得率為2.38%，而表中A3B1C3D2的得率為2.35%。由此可見，從提取率和能源節(jié)約兩方面綜合考慮，A3B1C3D2可為最優(yōu)提取工藝。根據最優(yōu)提取工藝分別提取1、2、3次，結果表明，一次提取率為2.36%,兩次提取混合液為提取率為3.08%，三次提取混合液為3.44%，三次提取增幅很小，出于經濟因素考慮，取2次提取為宜，因此，超聲提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為：提取溫度65℃、料液比1:25(g/mL)、超聲時間35min、pH為7，浸提2次。