1實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑

1．1實(shí)驗(yàn)試劑

乳酸發(fā)酵菌種:植物乳桿菌;發(fā)酵液500mL;電極室用水:0．3mol/L的Na2SO4溶液1000mL(陰極室和陽極室各500mL);酸室和堿室為蒸餾水。發(fā)酵培養(yǎng)基每升含:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖50g、乙酸鈉2g、檸檬酸二胺2g、吐溫-801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0．2g、一水硫酸錳0．05g。

1．2實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、發(fā)酵罐、干燥箱、電子天平、pH計(jì)、生物傳感分析儀、分光光度計(jì)、冰柜。其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)器皿:燒杯、量筒、玻璃棒、酒精燈、接種環(huán)、培養(yǎng)皿、移液管等。直流穩(wěn)壓電源;明道式電滲析膜堆一套，外配容量為1000mL的燒杯5只，硅膠管(約0．5m)10根;小型潛水泵5個。通過發(fā)酵罐控制主機(jī)箱上的蠕動泵，將雙極膜電滲析的堿液隔室與發(fā)酵罐進(jìn)行連接。為了降低發(fā)酵罐中染雜菌的風(fēng)險(xiǎn)，必須對連接的管子進(jìn)行滅菌操作。發(fā)酵罐內(nèi)由pH計(jì)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，當(dāng)pH低于設(shè)定值時，由蠕動泵自動將雙極膜電滲析的堿液隔室中的堿液泵入發(fā)酵罐進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于軟管內(nèi)是強(qiáng)堿環(huán)境，故堿液室與發(fā)酵罐之間的連接管不需要進(jìn)行滅菌操作。

2實(shí)驗(yàn)步驟

2．1雙極膜電滲析的準(zhǔn)備

(1)組裝膜堆:按“陽極板—隔板—雙極膜—隔板—陰膜—隔板—陽膜—隔板—雙極膜—陰極板”順序組裝膜堆，用長螺桿釘壓緊膜堆。為了確保裝置的嚴(yán)密性，應(yīng)使隔板之間的墊圈厚度不超過墊圈槽，并使雙極膜的陽膜側(cè)朝向陰極板。此外，在用螺釘壓緊裝置時，應(yīng)注意均勻用力，以防止裝置變形甚至斷裂。

(2)連接外圍設(shè)備:在隔板出口分別連接出水管和進(jìn)水管。將進(jìn)水管與外置燒杯中的潛水泵出口連接，將出水管的出口端連接到燒杯中，以確保循環(huán)通路暢通。

(3)注入料液和電極水:在鹽室中注入料液，在極室中注入電極水，在酸室和堿室中注入蒸餾水，此過程應(yīng)保證料液淹沒潛水泵。對于雙極膜電滲析，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各個隔室、燒杯和潛水泵內(nèi)的料液或電解質(zhì)溶液清洗干凈。若長期不用，應(yīng)將裝置拆卸還原，并確保各組件干燥和清潔。

2．2發(fā)酵過程的準(zhǔn)備

(1)種子培養(yǎng)基的培養(yǎng):配制一定量的種子培養(yǎng)基，并在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。滅菌條件為:121℃，20min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，取新鮮斜面菌種，接入種子培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床中培養(yǎng)24h，溫度恒定在37℃。

(2)發(fā)酵罐滅菌:將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中，此處應(yīng)注意體積不能超過發(fā)酵罐總體積的2/3。然后將發(fā)酵罐和培養(yǎng)基一起放入滅菌鍋中進(jìn)行滅菌。

(3)火焰接種法:先用醫(yī)用酒精擦拭接種口;在火圈中加入酒精，點(diǎn)燃后套在接種口上;關(guān)小空氣進(jìn)氣閥，調(diào)節(jié)進(jìn)風(fēng)，降低罐壓，打開接種口蓋;在火焰范圍內(nèi)打開種子培養(yǎng)基的瓶塞，在火焰上燒灼幾秒鐘后，迅速將種子液倒入發(fā)酵罐中;在火焰上燒灼接種口蓋子數(shù)秒后，迅速蓋好接種口蓋，關(guān)閉空氣進(jìn)氣閥。

(4)發(fā)酵培養(yǎng):接種結(jié)束后，對發(fā)酵培養(yǎng)過程的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，開始培養(yǎng)。發(fā)酵過程中要打開冷凝器水閥。具體操作參數(shù):轉(zhuǎn)速為150r/min;溫度為37℃;pH為6．7。

2．3發(fā)酵罐與雙極膜電滲析集成操作過程的監(jiān)測

在集成操作過程中，要對發(fā)酵罐和雙極膜電滲析同時進(jìn)行監(jiān)測，防止任一方出現(xiàn)問題導(dǎo)致集成操作失敗。發(fā)酵過程:

①通過發(fā)酵罐的主機(jī)控制發(fā)酵的pH條件、溶氧濃度和實(shí)驗(yàn)溫度。每1h記錄pH、溫度和溶氧濃度，通過數(shù)據(jù)判斷發(fā)酵過程是否正常;

②每4h測量殘余葡萄糖的量、生物量和乳酸的生成量，以判斷細(xì)菌的生長情況和乳酸的生成情況。雙極膜電滲析過程:

①雙極膜電滲析過程調(diào)整穩(wěn)壓電源的電壓和電流值來控制實(shí)驗(yàn)條件，每1h記錄電壓、電流。

②每4h測量酸室中的乳酸濃度、堿室濃度和堿室堿液體積。

3分析方法

3．1葡萄糖和乳酸的測量

在發(fā)酵過程中，要間斷地取樣進(jìn)行監(jiān)測。發(fā)酵液中含有有機(jī)酸鹽、無機(jī)鹽、菌絲體、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等。雙極膜電滲析過程的料液是經(jīng)過超濾和脫色之后的發(fā)酵液，主要成分為有機(jī)酸鹽(主要為乳酸鹽)和無機(jī)鹽類物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中使用生物傳感分析儀獲得葡萄糖和乳酸含量。

3．2生物量的測量

在發(fā)酵過程中，要及時監(jiān)測乳酸菌的生長情況。取樣后，用0．3mol/L的稀鹽酸溶液稀釋，目的是消除一些沉淀性鹽的影響。在波長為600nm處，測量吸光度。對于產(chǎn)酸量(Na)、產(chǎn)堿量(Nb)以及它們各自的電流效率(ηa和ηb)，可根據(jù)下面的公式計(jì)算

4實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需要完成乳酸發(fā)酵液的初步提取工作。應(yīng)及時向發(fā)酵罐中加入NaHCO3，使pH升高到10左右。同時升高溫度至90℃，使菌體和其他懸浮物下沉。發(fā)酵原液澄清后，將上清液收集到塑料桶中，放入冰柜中保存并用于下一步的提純。對澄清后的沉淀物集中進(jìn)行處理。

(2)在利用發(fā)酵罐控制主機(jī)進(jìn)行發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)時，要控制堿液的添加速度，以使堿液與發(fā)酵液充分混合反應(yīng)，并確保發(fā)酵液的pH不被調(diào)節(jié)得過高而影響微生物生長。

(3)如果裝置發(fā)生泄漏，應(yīng)盡快壓緊裝置;如果情況得不到改善，應(yīng)拆卸裝置、查找原因(或更換墊圈、或增加墊圈厚度等)。在實(shí)驗(yàn)完畢后，應(yīng)將隔室、燒杯和潛水泵內(nèi)的料液或電解質(zhì)溶液清洗干凈。若長期不用，應(yīng)拆卸還原裝置，并確保各組件干燥和清潔。

作者：馮紅艷 徐銅文 王曉林 楊偉華 單位：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心