石斑魚(yú)肉肽粉的氨基酸組成分析與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

　　摘要 以珍珠龍膽石斑魚(yú)魚(yú)肉為材料，采用生物酶解法制備蛋白酶解產(chǎn)物并進(jìn)行超濾處理，分析了酶解產(chǎn)物和各超濾組分的粗蛋白含量和氨基酸組成，評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。結(jié)果表明，珍珠龍膽石斑魚(yú)的酶解產(chǎn)物和各超濾組分的粗蛋白含量為 63.41%~67.53%，膠原蛋白含量為 3.65%~5.97%，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的比例為 67.09%~71.52%;酶解產(chǎn)物和各超濾組分的必需氨基酸組成齊全、含量豐富、比例相對(duì)均衡，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。經(jīng)過(guò)超濾分離的石斑魚(yú)肉肽粉可作為具有多種生物活性功能產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料。

　　徐杰; 廖津; 林澤安; 唐振冬; 范秀萍; 孫欽秀; 劉書(shū)成; 蘇偉明， 食品與發(fā)酵工業(yè) 發(fā)表時(shí)間：2021-08-25 10:03 期刊

　　關(guān)鍵詞 酶解產(chǎn)物;蛋白質(zhì);氨基酸;營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;珍珠龍膽石斑魚(yú)

　　珍珠龍膽石斑魚(yú)(Epinephelus fuscoguttatus×E. lanceolatus)，屬于鱸形目、鮨科、石斑魚(yú)屬，具有成長(zhǎng)快、病害少、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)膩、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)南方海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，年產(chǎn)量高達(dá) 10 萬(wàn) t，產(chǎn)值超 100 億元[1-3]。珍珠龍膽石斑魚(yú)的銷(xiāo)售主要以活魚(yú)為主，但由于保活流通技術(shù)的限制，其死亡率較高，死亡石斑魚(yú)的銷(xiāo)售價(jià)格大大降低。針對(duì)死亡的珍珠龍膽石斑魚(yú)，采用一些技術(shù)手段開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品(如酶解制備活性肽、提取魚(yú)油等)，可以提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

　　目前，利用水產(chǎn)蛋白通過(guò)酶解制備生物活性肽是研究和消費(fèi)市場(chǎng)關(guān)注的熱點(diǎn)之一。因?yàn)檫@類(lèi)生物活性肽具有抗氧化、降血壓、抗凝血、提高免疫力等多種生理功能，且容易被機(jī)體吸收[4-7]。珍珠龍膽石斑魚(yú)肉是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源(85.19%，干背基)，必需氨基酸(essential amino acid，EAA)含量高(34.56%，干背基)[8]，是開(kāi)發(fā)生物活性肽的優(yōu)質(zhì)原料，但相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。

　　本研究以保活流通過(guò)程中死亡的珍珠龍膽石斑魚(yú)為對(duì)象，采用生物酶解制備小分子肽，并對(duì)其超濾處理，分析超濾組分的蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成，評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為利用珍珠龍膽石斑魚(yú)肉酶解產(chǎn)物開(kāi)發(fā)生物活性肽提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)其高值化利用。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　珍珠龍膽石斑魚(yú)來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保活流通試驗(yàn)中剛死亡的，魚(yú)體完整、健康，個(gè)體質(zhì)量為(500±50) g。取魚(yú)肌肉，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)搗碎后，等量分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　風(fēng)味蛋白酶(酶活力 30 000 U/g)，廣西南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;檸檬酸鈉，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;分子標(biāo)準(zhǔn)品：桿菌酶(M：1 450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M：451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M：189 Da)，乙腈(色譜純)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;羥脯氨酸測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所;鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng);BSA224S-CW 型萬(wàn)分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;Varioskan Flash 型酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司; pHS-3C 型雷磁 pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;VAP450 型全自動(dòng)凱氏定氮儀，德國(guó)格哈特分析儀器有限公司;L-8900 型全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司;LC20AD 型高效液相色譜儀，日本島津公司。

　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.3.1 石斑魚(yú)肉酶解產(chǎn)物超濾組分的制備

　　采用課題組前期優(yōu)化的酶法工藝[9]制備珍珠龍膽石斑魚(yú)肉酶解產(chǎn)物(enzymatic hydrolysates， EH)，具體工藝參數(shù)如下：魚(yú)肉與水的比例 1:3.5、pH 7、溫度 53 ℃、風(fēng)味蛋白酶添加量 1 050 U/g，酶解 5.5 h 后煮沸滅酶，再冷卻至室溫，離心取上清液。分別采用 8、5、3 kDa 的超濾膜對(duì)酶解液進(jìn)行分離，獲得 4 種組分：EH-1(>8 kDa)、EH-2(5~8 kDa)、EH-3(3~5 kDa)和 EH-4(<3 kDa);對(duì) 4 種組分分別進(jìn)行蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥，獲得 4 種魚(yú)肉肽粉產(chǎn)品。

　　1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

　　參考 GB 5009.5—2016，采用凱式定氮法測(cè)定魚(yú)肉肽粉的蛋白質(zhì)含量。

　　1.3.3 膠原蛋白含量測(cè)定

　　羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白中，而在其他蛋白中含量較少，甚至不存在。本實(shí)驗(yàn)采用試劑盒法測(cè)定魚(yú)肉肽粉中的羥脯氨酸含量，然后乘以換算系數(shù)轉(zhuǎn)換為膠原蛋白含量。水生動(dòng)物的換算系數(shù)一般為 11.1[10]，膠原蛋白含量計(jì)算如公式(1)所示：膠原蛋白含量(μg/mg) = 羥脯氨酸含量(μg/mg) × 11.1 (1)

　　1.3.4 氨基酸組成測(cè)定

　　參考 GB 5009.124—2016，采用酸水解進(jìn)行前處理后測(cè)定魚(yú)肉肽粉的氨基酸組成。

　　1.3.5 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

　　參考 GB/T 22729—2008，采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定魚(yú)肉肽粉的相對(duì)分子質(zhì)量分布。

　　1.3.6 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

　　采用氨基酸評(píng)分(amino acid score，AAS)、化學(xué)評(píng)分(chemical score，CS)、氨基酸比值(ratio of amino acid，RAA)、氨基酸比值系數(shù)(ratio coefficient，RC)、氨基酸比值系數(shù)分(score of ratio coefficient，SRC)，對(duì)魚(yú)肉肽粉進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[11-12]。

　　1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

　　每個(gè)試驗(yàn)重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;用 SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析和 Duncan 多重比較進(jìn)行組間顯著性分析，P<0.05 表示顯著性差異。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 魚(yú)肉肽粉的粗蛋白和膠原蛋白含量

　　從表 1 可知，石斑魚(yú)肉肽粉中粗蛋白含量較高，達(dá)到 63%以上，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源。包斐[13] 采用酶解法制備長(zhǎng)蛇鯔魚(yú)肉蛋白粉，其蛋白含量高達(dá) 74.68%，略高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這可能與酶解制備工藝有關(guān)，還可能與魚(yú)的品種有關(guān)。石斑魚(yú)肉肽粉的膠原蛋白含量較低，在 5%左右。張延華等[14] 測(cè)定了鱸魚(yú)、鮻魚(yú)、草魚(yú)和鯉魚(yú)等魚(yú)肉中的膠原蛋白，其含量與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。雖然石斑魚(yú)肉肽粉中膠原蛋白含量偏低，但其具有較強(qiáng)的抗氧化等生物活性，可以增強(qiáng)其肽粉的功能特性。

　　2.2 魚(yú)肉肽粉的氨基酸組成

　　從表 2 可知，EH-2 未檢出天冬氨酸和絲氨酸，EH、EH-1、EH-3、EH-4 均含有 16 種氨基酸;5 種魚(yú)肉肽粉均含有 7 種人體 EAA(色氨酸未測(cè))，總氨基酸含量(total amino acids，TAA)在 16.47~18.81 g/100g，EAA 含量在 11.11~13.44 g/100g，其 EAA 占 TAA 的比例在 67.09%~71.52%。F 值是指支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)與芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)含量的比值，F(xiàn) 值越大說(shuō)明蛋白質(zhì)潛在的生物活性可能越好[15]。從表 2 可知，魚(yú)肉肽粉經(jīng)過(guò)超濾分離后，各分離組分的 F 值比未分離 EH 的高，說(shuō)明超濾分離可以提高肽粉的潛在生物活性功能。

　　從表 2 還可知，石斑魚(yú)肉肽粉的亮氨酸含量最高(2.95~3.85 g/100g)，較高的亮氨酸水平飲食對(duì)激活胰島素信號(hào)通路有著重要作用，從而增強(qiáng)機(jī)體的糖酵解和脂肪酸的合成[16]，此外，與亮氨酸同屬于支鏈氨基酸的纈氨酸和異亮氨酸的含量也比較豐富，有增強(qiáng)免疫力、防止肌肉損傷的功能。石斑魚(yú)肉肽粉的賴(lài)氨酸含量也較高，占氨基酸總量的 8.6%以上。賴(lài)氨酸是谷物類(lèi)食品的第一限制氨基酸，故石斑魚(yú)肉肽粉可作為以谷物為主的膳食模式的賴(lài)氨酸補(bǔ)充劑，同時(shí)賴(lài)氨酸還具有促鈣吸收、促食欲、促進(jìn)幼兒生長(zhǎng)發(fā)育、減輕焦慮等功能[17]。石斑魚(yú)肉肽粉的苯丙氨酸含量也較高，達(dá)到了 1.96 g/100g 以上。苯丙氨酸可以調(diào)節(jié)人體中酪氨酸的濃度[18]，合成神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機(jī)體代謝。石斑魚(yú)魚(yú)肉肽粉的精氨酸同樣含量豐富，均在 1.7 g/100g 以上，占 TAA 含量的 10%左右。精氨酸是嬰兒的 EAA，也是人體多種物質(zhì)的合成底物，如肌酸、NO、多胺、脯氨酸、谷氨酸和高精氨酸等，與血管舒張、免疫、神經(jīng)傳遞、能量代謝和預(yù)防多個(gè)系統(tǒng)的功能障礙有關(guān)[19]。因此，石斑魚(yú)肉肽粉是 1 種較好的人體 EAA 來(lái)源，可作為開(kāi)發(fā)適合各年齡階段的功能食品原料。

　　2.3 魚(yú)肉肽粉的呈味特征

　　蛋白酶解產(chǎn)物的呈味特征很大程度取決于氨基酸的種類(lèi)與含量[20]。味道強(qiáng)度值(taste activity value，TAV)是評(píng)價(jià)呈味物質(zhì)對(duì)呈味特征貢獻(xiàn)程度的重要指標(biāo)，它是指呈味物質(zhì)的濃度與其呈味閾值的比值。當(dāng) TAV < 1 時(shí)，說(shuō)明該呈味物質(zhì)對(duì)呈味特征的貢獻(xiàn)較小;TAV 越大說(shuō)明該呈味物質(zhì)對(duì)呈味特征的貢獻(xiàn)越大。石斑魚(yú)肉肽粉的呈味特征見(jiàn)表 3。從表 3 可知，石斑魚(yú)肉肽粉的呈味特征為苦味>>鮮味>甜味。且除脯氨酸和酪氨酸 TAV < 1 外，魚(yú)肉肽粉中其他氨基酸 TAV 均>1。

　　谷氨酸和天冬氨酸能為食品提供鮮味，決定食品的鮮美程度，且普遍認(rèn)為谷氨酸對(duì)鮮味的作用大于天冬氨酸，同時(shí)各組分谷氨酸的 TAV 值均大于天冬氨酸的 TAV 值，因此，谷氨酸是石斑魚(yú)肉肽粉的主要鮮味來(lái)源。各組分的甜味氨基酸 TAV 值均為丙氨酸最高，明顯高于其他甜味氨基酸，是甜味的主要來(lái)源。研究表明[15]，丙氨酸是水產(chǎn)品中重要的甜味氨基酸，可與谷氨酸等鮮味氨基酸協(xié)同呈鮮。

　　蛋氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等為魚(yú)肉肽粉貢獻(xiàn)較多的苦味，故該肽粉整體呈現(xiàn)苦味。有研究表明[23]，水產(chǎn)蛋白的酶解產(chǎn)物通常具有一定的苦味，這是由于在酶解過(guò)程大分子蛋白質(zhì)水解成小肽，較多的疏水性氨基酸和堿性氨基酸暴露。根據(jù)相關(guān)研究[24]，含有苦味的物質(zhì)分子質(zhì)量在 1 kDa 以下的占 85.1%，而魚(yú)肉肽粉正是小分子肽產(chǎn)品。通過(guò)促進(jìn)多肽的卷曲，使疏水性氨基酸隱藏在肽鏈內(nèi)部，以及深度酶解促使疏水性氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為游離氨基酸，都能使肽粉的苦味減少[25]。

　　2.4 魚(yú)肉肽粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

　　當(dāng)前營(yíng)養(yǎng)學(xué)界認(rèn)為：蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與其氨基酸組成有關(guān)，當(dāng)食物蛋白質(zhì)的氨基酸模式越接近于人體蛋白質(zhì)構(gòu)成時(shí)，被機(jī)體利用的程度越高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也越高。目前，AAS 和 CS 是評(píng)價(jià)氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最主要的方法，但是具有片面性，而世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)/聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)提出以氨基酸模式來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)根據(jù)氨基酸模式來(lái)計(jì)算 RAA、RC 以及 SRC，可以較為直觀(guān)反映樣品氨基酸含量偏離氨基酸模式的程度及 EAA 對(duì)氨基酸平衡的影響[26]，綜合運(yùn)用這些方法可以較為全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)樣品的相對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

　　AAS 是指樣品中某種 EAA 的含量與 FAO/WTO 推薦的理想蛋白同種氨基酸含量的比值，其中最小的 AAS 值就是該樣品的氨基酸分，AAS 最小的 EAA 被稱(chēng)為該樣品的第一限制氨基酸。如果樣品中某種 EAA 的 AAS<1，說(shuō)明該樣品的 EAA 模式不滿(mǎn)足 FAO/WTO 推薦的理想蛋白模式，其蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值偏低;如果樣品所有 EAA 的 AAS 都>1，說(shuō)明該樣品的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。石斑魚(yú)肉肽粉的 AAS 為 1.56，經(jīng)超濾處理后除了 EH-2 組分外，其他分離組分的 AAS 均>1，這也說(shuō)明石斑魚(yú)肉肽粉及其超濾分離組分均有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。李慧凝等[27]以酶解法制備鰹魚(yú)肽，鰹魚(yú)肽的 AAS 均近似或大于 1.0。因此，從蛋白質(zhì)角度來(lái)講，魚(yú)肉肽具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

　　CS 是指樣品中某種 EAA 含量與雞蛋蛋白中同種氨基酸含量的比值，其比值的意義與 AAS 一樣。石斑魚(yú)肉肽粉的 CS 分別為 1.19、1.19、0.32、1.52、1.45，說(shuō)明除 EH-2 外其他組分的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在一定程度上優(yōu)于雞蛋蛋白質(zhì)。

　　蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與其 EAA 的種類(lèi)、數(shù)量及平衡狀態(tài)密切相關(guān)。從表 6 可知，石斑魚(yú)肉肽粉的 EAA 占 TAA 的比值除 EH-2 組分的蘇氨酸外，均優(yōu)于模式值。石斑魚(yú)肉肽粉 EAA 中亮氨酸占比特別高，為模式值的 2.5 倍以上;苯丙氨酸+酪氨酸以及賴(lài)氨酸占比也較高，為模式值的 2 倍以上。單個(gè)氨基酸占比過(guò)高或過(guò)低于模式值均會(huì)影響氨基酸平衡，但是各組分的 EAA 占比的變化規(guī)律與模式值相似。總體而言，該肽粉的 EAA 種類(lèi)齊全，含量豐富，且組成合理，是 1 種優(yōu)質(zhì)氨基酸產(chǎn)品。

　　通過(guò)計(jì)算 EAA 的 RAA、RC、SRC 來(lái)評(píng)價(jià)樣品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。從表 7 可知，EH-3 的 SRC 值最高達(dá)到了 80.43，EH-2 的 SRC 值較低為 53.44，各樣品的氨基酸平衡性為：EH-3 > EH-1 >EH > EH-4 >EH2，且蛋氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸及苯丙氨酸+酪氨酸的 RC 值接近 1，表明 5 種 EAA 含量比例與氨基酸模式最接近。各組分的亮氨酸的 RC 值最高，但蘇氨酸和纈氨酸的 RC 值均<1，EH、EH-1、EH-2 的第一限制氨基酸為蘇氨酸，同時(shí) EH-2 的蘇氨酸 RC 值只有 0.19，對(duì)氨基酸平衡起著很大的負(fù)作用;而 EH-3、EH-4 的第一限制氨基酸為纈氨酸。綜上所述，石斑魚(yú)肉肽粉是 1 種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的海洋來(lái)源蛋白。

　　2.5 魚(yú)肉肽粉的相對(duì)分子質(zhì)量分布

　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果[9]及 SRC，選取石斑魚(yú)肉肽粉中抗氧化活性較高同時(shí)比值系數(shù)分最高的組分 EH-3，分析其相對(duì)分子質(zhì)量分布。從圖 1 可知，EH-3 分子質(zhì)量為 249 Da，且 EH-3 組分中分子質(zhì)量在 1 kDa 以下的含量為 97%，說(shuō)明經(jīng)過(guò)酶解之后的魚(yú)肉大部分降解為小分子肽，容易被人體吸收[29]。巫楚君等[30]通過(guò)復(fù)合蛋白酶酶解黃鰭金槍魚(yú)肉，其酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大部分在 1 kDa 以下，本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。

　　3 結(jié)論

　　珍珠龍膽石斑魚(yú)肉肽粉是 1 種高蛋白食物，粗蛋白質(zhì)含量達(dá) 63.41%以上;魚(yú)肉肽粉的 EAA 組成齊全、含量豐富、比例相對(duì)均衡，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。經(jīng)過(guò)超濾分離的石斑魚(yú)肉肽粉為開(kāi)發(fā)具有多種生物活性功能產(chǎn)品提供了優(yōu)質(zhì)的原料，然而肽粉還呈現(xiàn)出一定的苦味，如何消減或消除肽粉的苦味還有待于進(jìn)一步深入研究。